2019 Fiscal Year Research-status Report

非結核性抗酸菌に対する等温増幅法を用いたクラリスロマイシン耐性遺伝子検出法の開発

Research Project

Project/Area Number	19K16444
Research Institution	Nagoya University
Principal Investigator	稲垣孝行名古屋大学, 医学部附属病院, 病院薬剤師 (90835406)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2021-03-31
Keywords	クラリスロマイシン / Mycobacterium avium / 薬剤耐性遺伝子 / 23SrRNA / ARMS法 / LAMP法 / 肺MAC症 / 非結核性抗酸菌
Outline of Annual Research Achievements	クラリスロマイシン(CAM)は、非結核性抗酸菌が引き起こす肺MAC症における薬剤感受性試験の結果を考慮すべき唯一の治療薬である。本研究では、遺伝子変異検出法であるARMS法及び等温遺伝子増幅法であるLAMP法を応用し、CAM耐性の有無を判定するARMS-LAMP法を開発することを目的としている。令和元(2019)年度の研究実施計画は、M.aviumにおけるARMS-LAMP法に用いるプライマーの設計および臨床分離株に対するシステムの構築である。 M.avium基準株および肺M. avium症患者由来株を使用し、以下の研究成果が得られた。１．肺M.avium症患者由来株18株に対し、CAMの薬剤感受性試験を実施した結果、10株が耐性株であり、残りの8株が感受性株であった。CAMの薬剤耐性遺伝子領域 (23SrRNA)のDNAシーケンス解析の結果、感受性8株は全て野生型であり、耐性株は10株全て変異型であった。以上の結果から薬剤感受性試験と薬剤耐性遺伝子の変異との相関性があった。２．ゲノム基準株であるM.avium104基準株における23SrRNAに対するデータより、LAMP法プライマー設計支援ソフトを用いて、最も至適条件の高い野生型検出用プライマーセット(WTPS)及び変異型検出用プライマーセット (MTPS)を設計し、臨床分離株に対してARMS-LAMP法を実施した。WTPSは、基準株および全ての野生型株8株でLAMP反応が認められたが、変異型株の複数の検体でもLAMP反応が認められた。一方、MTPSは、基準株および野生型株8株でLAMP反応が認められなかったが、全ての変異型株10株でLAMP反応が認められた。以上の結果より、MTPSのみを用いてARMS-LAMP法を実施することによりM.aviumにおけるCAM耐性の有無を検出し、臨床応用できる可能性が強く示唆された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 理由：令和元(2019)年度の研究目的は、M. aviumにおけるARMS-LAMP法に用いるプライマーの設計および臨床分離株を用いたシステムの構築である。令和元(2019)年度の研究実施計画に基づいて実施した研究の進捗状況から、下記の理由により、当該年度における達成度については、概ね達成できたと考える。１．プライマーの設計に関して ARMS-LAMP法とは、F1cまたはB1cの5’末端に変異部位が重なるようにプライマーを設計し、変異部位より1または2塩基3’側にミスマッチ塩基を加えることで合計2箇所のミスマッチ部分が存在することでアニーリングができなくなり、LAMPでの増幅ができなくなる方法である。LAMP法プライマー設計支援ソフト「PrimerExplorerV5」を用いて、野生型検出用プライマーセット(WTPS)及び変異型検出用プライマーセット (MTPS)を設計した。本研究において変異箇所は隣り合った2箇所の変異であるため、これら2箇所をB1cの5’末端側とし、5’末端側から3番目の塩基をテンプレートDNAであるチミン(T)におけるミスマッチ強度が最も強いシトシン(C) をミスマッチ塩基とした。２．臨床分離株を用いたシステムの構築に関して設計したWTPS及びMTPSを用いて、臨床分離株に対してARMS-LAMP法を実施した。M. aviumの特徴として野生型と変異型の両方を含む混合型が存在するため、WTPSは、複数の変異型株でもLAMP反応が認められたことが示唆される。一方、MTPSは、変異型株10株のみでLAMP反応が認められた。MTPSのみを用いたARMS-LAMP法は、M. aviumにおけるCAM耐性の有無を判定可能であり、臨床上重要な知見を得ることができた。
Strategy for Future Research Activity	本研究課題の今後の推進方策について、MAC菌株を培養後に抽出したDNAにてARMS-LAMP法を用いてCAM耐性遺伝子変異を数時間で簡便にCAM耐性化の有無を判定できるシステムを確立することを追究する。そのため、令和2(2020)年度の研究期間中に下記の事項についての解析を行う。１．M. intracellulareは、M. aviumと23S rRNAのDNA配列が若干異なる。そのため、全ゲノム解析を既に完了しているM. intracellulare基準株における23S rRNAに対するデータを用いて、M. avium株およびM. intracellulare株のどちらにも対応可能なプライマーセットをPrimerExplorerV5により設計する。M. avium臨床分離株およびM. intracellulare臨床分離株に対するARMS-LAMP法を実施する。２．LAMP法にて使用するプライマーセットにループプライマー (LP) を追加した場合、増幅時間を30分以内に短縮することができる。PrimerExplorerV5によりLPを設計し、MTPSにLPを追加してARMS-LAMP法を実施し、増幅時間の短縮の可能性について検証する。３．本研究は、一般病院・開業医院での実用化を目指しており、LAMP法に専用の機器を使用せず、紫外線照射装置 (UVランプ) を用いて目視による検出について調べる。Loopamp蛍光・目視検出　試薬を追加してARMS-LAMP法を実施し、蛍光強度による目視検出の可能性について検証する。
Causes of Carryover	令和元(2019)年度分については、ほぼ使用済みとなった。年度末納品等に係る支払いが令和2(2020)年4月1日以降となったため、研究費の次年度への繰り越しが生じた。当該支出分については、令和2(2020)年度の実支出額に計上する予定である。また、令和元(2019)年度の研究実施計画において、M. avium臨床分離株40株程度をDNAシーケンス解析およびARMS-LAMP法を実施する予定であったが、全ての菌株を実施することができなかった。上記計画については、令和2(2020) 年度において引き続き実施する予定であり、繰り越した研究費を使用する予定である。令和2(2020)年度の研究実施計画に従って、研究を遂行するため、以下の様に研究費を執行する予定である。１．M. avium株およびM. intracellulare株のどちらにも対応可能なARMS-LAMP法に用いるプライマーセットを設計し、臨床分離株を用いたシステムの構築をする。２．LPを設計し、MTPSにLPを追加してARMS-LAMP法を実施し、増幅時間の短縮の検討を行う。３．Loopamp蛍光・目視検出試薬を追加して、ARMS-LAMP法における蛍光強度による目視検出の検討を実施する。