薬物トランスポーターTETRANの基質認識・輸送特性の解明

2021 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19K16456
• Research Institution: Aichi Gakuin University
• Principal Investigator: 川嵜 達也 愛知学院大学, 薬学部, 講師 (70722073)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: トランスポーター / 輸送 / TETRAN

Outline of Annual Research Achievements

HEK293細胞発現系を用いて，以下の検討を行った。
1)安定発現株の構築 G418を用いて選択培養し，TETRAN安定発現株を樹立した。TETRAN抗体（Invitrogen PA5-116158）および抗beta-actin抗体を用いたウェスタンブロットによりTETRANの過剰発現を確認した。
2)蛍光基質の同定 初年度の一過性発現株を用いた検討と同様に，TETRAN安定発現株を用いて蛍光基質を探索した。検討したカチオン性蛍光色素のうち，rhodamine 123のみがMock細胞に対して，TETRAN安定発現株に蓄積した。この輸送はMichaelis-Menten型の濃度依存性を示したが，rhodamine123濃度が30 μM以上では，Mock細胞と差が見られなくなった。以降の検討は0.5 μMで実施した。
3)阻害剤探索 主要なアニオン性薬物はrhodamine 123輸送を阻害しなかった。一方，種々カチオン性薬物が阻害剤であり，IC50がμM orderの阻害剤として，clonidine, decynium 22, diphenhydramine, YM155, MPP+, pyrilamineを同定した。TETRAN酵母ホモログTpoIの基質であるポリアミン類（スペルミン，スペルミジン，アグマチン，プトレシン）はrhodamine 123輸送を阻害しなかった。
4)Competitive counter flow法を用いた基質の確認 rhodamine輸送がplateauに到達後，細胞外液をrhodamineおよび阻害剤を含む液に交換した際の平衡移動から阻害剤のうち，decynium 22, diphenhydramine, YM155, MPP+, pyrilamineが基質であることが示唆された。
以上得られた成果を元に，現在論文投稿準備中である。