回転拡散を利用した螢光相関分光による細胞骨格蛋白分子の重合過程の解析

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K16471
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 川岸 将彦 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (60323606)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 細胞骨格 / 螢光相関分光

Outline of Annual Research Achievements

1. 研究の成果の内容:
本研究は、回転拡散を利用した螢光相関分光法(Fluorescence Correlation Spectroscopy, FCS)により、細胞骨骼蛋白分子の重合の過程を観察する事を目的とする。平成31年/令和元年度は、今までに組み上げてきた螢光相関分光法の光学系を、並進拡散だけでなく、回転拡散の観測にも対応出来るように改造する作業を行った。回転拡散を観測するためには、回転する螢光分子から発せられる偏光の向きの差が強度の差に反映されるような偏光光学部品を光路に加えた。また、通常の蛋白試料が、光学顕微鏡の観測領域程度の距離をを並進拡散するのにはマイクロ秒程度の時間がかかるが、蛋白の向きが回転拡散するのには、ナノ秒程度の時間がかかり、非常に高速である。そのため高速の光子検出器のアフターパルスの誤差の迂回と、非常に高速の光子を見逃す偽陰性への対応のため光路をビームスプリッターで分岐して並列化した。光学系が長くなり、部品も増えるので、従来よりも精密な位置合わせの調整が必要であった。現在は、組み上げた光学系を用いて、簡単な螢光分子などの試料を測定し、更に位置合わせを繰返し、精度を上げるための調整を続けている。
2. 意義、重要性等:
回転拡散は、並進拡散よりも、螢光分子の分子量の変化に鋭敏なので、それを利用した螢光相関分光法は、対象分子の相互作用による分子量の変化を鋭敏に、しかも溶液の中で直接観観察する事ができるという意義がある。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

平成31年/令和元年度の研究実施計画では、従来の螢光相関分光法の光学系を、並進拡散だけでなく、回転拡散の観測も出来るるように改造する事が主な項目であった。その改造の作業は予定通りに進行し、現在は精密な位置合わせなどを行って、精度を上げる調整をする段階に至っている。アフターパルスが少ない高速の光子検出器として、ハイブリッドフォトディテクタ(HPD)を導入する事が計画されており、光学系の調整が十分出来たところで、現在の光電子増倍管による測定と切り換える予定である。

Strategy for Future Research Activity

令和2年度は、当初の予定通りに、螢光偏光の回転拡散を利用した螢光相関分光法の光学系を用いて、細胞骨格蛋白分子の重合の初期過程を観察する事を目指す。主に、線維芽細胞など多くの細胞に発現するビメンチンと、神経組織に多く発現するニューロフィラメント蛋白との二つの蛋白を対象にするが、アクチンや他の蛋白も視野に入れたい。先づ、精製した蛋白を螢光標識し、それを用いて再構成系を作る。そして重合に影響を与え得る因子の効果を、螢光相関分光法を用いて評価したい。例えば、中間径フィラメントの重合状態に変化を与え得る薬剤として、WithaferinAが報告されているが、その作用機序には複数の矛盾した報告があるので調べてみる。また、その他の候補薬剤についても、フィラメント蛋白への直接に作用しうるのかを調べる。再構成系において効果が見られたら、培養細胞での検証に進みたい。具体的には、中間径フィラメントを欠く事が知られているSW13(vim-)細胞に、螢光蛋白と融合させた中間径フィラメント蛋白を発現させ、フィラメントが形成される直前の時期の、中間径フィラメント蛋白の重合状態を調べることを考えている。

Causes of Carryover

アフターパルスが少ない高速の光子検出器として、ハイブリッドフォトディテクタ(HPD)を導入する事が研究実施計画の上では平成31年/令和元年度に予定されていた。しかし、光学系の位置合わせ調整が十分に進んだ時点で導入する事にしたので、それは令和2年度に購入する事に変更した。それが、次年度使用額が生じた理由である。COVID-19による研究活動の自粛が続くので、やや遅れるかもしれないが、令和2年度中に購入する予定である。