回転拡散を利用した螢光相関分光による細胞骨格蛋白分子の重合過程の解析

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K16471
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 川岸 将彦 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (60323606)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 細胞骨格 / 螢光相関分光

Outline of Annual Research Achievements

1. 研究の成果の内容:
本研究は、回転拡散を利用した螢光相関分光法(Fluorescence Correlation Spectroscopy, FCS)により、細胞骨格タンパク分子の重合の過程を観察する事を目的とする。前年度までに、研究室で組み上げてきた螢光相関分光法の光学系を、並進拡散だけでなく、回転拡散の観測にも対応出来るように改造する作業を行った。令和2年度は、光学系の安定性を上げ、測定の精度を上げるための調整、修正の作業を行った。従来の並進拡散に比べて部品も増え、光学系も長くなるので、種々の原因で、光路が乱されて測定が少しずつ劣化する事があった。乱れる位置としては、特にピンホール付近と、もう一つは、高速の光子検出器のアフターパルスの誤差の迂回と、高速の光子を見逃す偽陰性への対応のため、検出側の光路を分岐して並列して検出をしているが、その部分と、その二箇所でずれが生じやすかった。そこで、脆弱な箇所を同定し、設計を修正したり、部品をさし替えたりして系の安定性を増すように工夫した。現在は改めて、組み上げた光学系を用いて、簡単な螢光分子などの試料を測定し、更に位置合わせを繰返し、精度を上げるための調整を続けている。
2. 意義、重要性等:
回転拡散は、並進拡散よりも、螢光分子の分子量の変化に鋭敏なので、それを利用した螢光相関分光法は、対象分子の相互作用による分子量の変化を鋭敏に、しかも溶液の中で直接観観察する事ができるという意義がある。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

COVID-19による活動制限と混乱のため、自分自身の実験活動も、物品の調達も思うようにならない事が多かった。その為、測定系の調整に予定よりも長い時間がかかってしまった。

Strategy for Future Research Activity

アフターパルスが少ない高速の光子検出器として、ハイブリッドフォトディテクタ(HPD)を導入する事が計画されており、光学系の調整が十分出来たところで、現在の光電子増倍管による測定と切り換える予定である。
令和3年度は、螢光偏光の回転拡散を利用した螢光相関分光法の光学系を用いて、細胞骨格蛋白分子の重合の初期過程を観察する事を目指す。主に、線維芽細胞など多くの細胞に発現するビメンチンと、神経組織に多く発現するニューロフィラメント蛋白との二つの蛋白を対象にするが、アクチンや他の蛋白も視野に入れたい。先づ、精製した蛋白を螢光標識し、それを用いて再構成系を作る。そして重合に影響を与え得る因子の効果を、螢光相関分光法を用いて評価したい。例えば、中間径フィラメントの重合状態に変化を与え得る薬剤として、WithaferinAが報告されているが、その作用機序には複数の矛盾した報告があるので調べてみる。また、その他の候補薬剤についても、フィラメント蛋白への直接に作用しうるのかを調べる。再構成系において効果が見られたら、培養細胞での検証に進みたい。具体的には、中間径フィラメントを欠く事が知られているSW13(vim-)細胞に、螢光蛋白と融合させた中間径フィラメント蛋白を発現させ、フィラメントが形成される直前の時期の、中間径フィラメント蛋白の重合状態を調べることを考えている。

Causes of Carryover

光学系の位置合わせ調整が十分に進んだ時点で、ハイブリッドフォトディテクタ(HPD)を導入する事を予定していたが、COVID-19による研究活動の遅れにより、昨年度内に到達出来なかった。それが、次年度使用額が生じた理由である。令和3年度中に購入する予定である。