回転拡散を利用した螢光相関分光による細胞骨格蛋白分子の重合過程の解析

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K16471
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 川岸 将彦 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (60323606)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 細胞骨格 / 螢光相関分光

Outline of Annual Research Achievements

1. 研究の成果の内容:
本研究は、回転拡散を利用した螢光相関分光法(Fluorescence Correlation Spectroscopy, FCS)により、細胞骨格タンパク分子の重合の過程を観察する事を目的とする。令和元年年度は、研究室で組み上げてきた螢光相関分光法の光学系を、並進拡散だけでなく、回転拡散の観測にも対応出来るように改造する作業を行った。令和2年度は、光学系の安定性を上げ、測定の精度を上げるための調整、修正の作業を行った。主に光路が弱くて乱れやすかった、ピンホール付近と、検出側の光路の分岐部分の改善を行った。令和3年度は、検出側の光路の分岐後の光学素子の調整や、検出器へ光を導入するファイバーのカップリングなどの補強や調整を行った。令和4年度は、引き続き、光学系の安定性と測定の精度を上げるための調整、修正の作業を行った。特に光路の切換え部分の脆弱な箇所の探索と調整とを行った。また、連携研究者の協力を得て、新たな高速の光子検出器の導入のための性能評価をして、機種選定を行った。現在は改めて、組み上げた光学系を用いて、簡単な螢光分子などの試料を測定し、更に位置合わせを繰返し、精度を上げるための調整を続けている。
2. 意義、重要性等:
回転拡散は、並進拡散よりも、螢光分子の分子量の変化に鋭敏なので、それを利用した螢光相関分光法は、対象分子の相互作用による分子量の変化を鋭敏に、しかも溶液の中で直接観観察する事ができるという意義がある。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

COVID-19による活動制限と混乱のため、自分自身の実験活動も、制限される事になった。また国内の活動制限が緩くなった後も、半導体の品薄から、検出器などの物品の調達も、思うようにならない時期が長く続いた。その為、測定系の調整に予定よりも長い時間がかかってしまった。

Strategy for Future Research Activity

アフターパルスが少ない新しい高速の光子検出器として、当初はハイブリッドフォトディテクタ(HPD)を想定していたが、新たに広まって来た他の光子検出器の性能比較した結果、シリコンフォトマルティプライア (SiPM) を導入する事にした。光学系の調整が十分出来たところで、現在の光電子増倍管による測定と切り換える予定である。
令和5年度は、令和4年度に続いて、螢光偏光の回転拡散を利用した螢光相関分光法の光学系を用いて、重合蛋白の重合の初期過程を観察する事を目指す。主に、線維芽細胞など多くの細胞に発現するビメンチンと、神経組織に多く発現するニューロフィラメント蛋白との二つの蛋白を考えていたが、神経変性疾患などで見られるアミロイド蛋白のフィブリル形成過程も対象にしてみたい。アミロイド蛋白のフィブリル形成過程を螢光相関分光で観察する場合、フィブリルに選択的に結合する螢光色素を使うが、これらの色素はフィブリル構造を染めるが、蛋白の種類への特異性は低い。一方、蛋白の種類に特異的に螢光偏光標識をするための、抗体様小分子を利用した新しいプローブが開発されているので、それを活用してみたい。公開されているデータベースの中からアミロイドに結合する抗体様小分子を選んで、それを利用した螢光偏光プローブの作製を試みる。in vitroのフィブリル形成実験を行って、螢光色素標識による螢光相関分光観測を行う。また、抗体小分子を利用した螢光偏光プローブでも、フィブリル形成過程の観察を行い、両者の特性を比較する事を考えている。

Causes of Carryover

光学系の位置合わせ調整が十分に進んだ時点で、新たな高速の光子検出器を導入する事を予定していた。研究開始当初は、ハイブリッドフォトディテクタ(HPD)を導入する事を想定していたが、新しい型の光電子増倍管や、シリコンフォトマルティプライア (SiPM) など優れた特性を示す光子検出器が広まってきているので、どの機器を導入するかを更に検討することにしたが、COVID-19による半導体などの品薄で、機種選定に時間がかかった。それが、次年度使用額が生じた理由である。