2019 Fiscal Year Research-status Report
Three-dimensional analysis of ultrastructral changes of nuclear membranes and chromosomes during cell division using electron microscopy
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19K16472
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| Research Institution | Niigata University |
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Principal Investigator |
早津 学 新潟大学, 医歯学系, 助教 (40468898)
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2019-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 電子顕微鏡 / 細胞分裂 / 核膜 / 染色体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞の分裂は生物にとって極めて重要な現象であり、古くからこれまでに多くの研究が行われている。しかし、分裂期の細胞の核に生じる一連の微細構造変化について電子顕微鏡技術を用いて三次元的に説明した報告は少ない。そこで本研究では、まず各細胞分裂期の細胞を効率よく得るため、細胞培養を用いてその培養条件の検討と透過型電子顕微鏡観察での微細構造の確認を行い、次に連続切片-三次元再構築法による各細胞分裂期の細胞の核膜、染色質および染色体の微細構造変化の解析、さらに免疫電子顕微鏡法を用いた核膜の局在変化の解析を行い、体細胞分裂時に生じる核膜の崩壊・消失および再形成と染色体形成過程について、微細構造学的にかつ三次元的に詳細を明らかにすることを目的とする。
本年度は、インドホエジカ胸腺由来培養細胞を材料として、細胞培養条件の検討、連続切片-三次元再構築法による各細胞分裂期の細胞の核膜、染色質および染色体の微細構造変化の解析を行った。その結果、細胞周期の同調のために用いた微小管重合阻害剤のコノダゾールの濃度と処理時間、細胞分裂前中期に同調させたのちの再培養時間を検討し、最適な細胞培養の条件を決定できた。また、この条件で得た各細胞分裂期の細胞を、透過型電子顕微鏡で微細構造を観察し、ノコダゾールが核膜、染色質および染色体の体細胞分裂時の構造変化に大きな影響を及ぼさないことも確認できた。さらに、連続切片-三次元再構築法による構造解析では、細胞分裂前期の凝集し始めた染色質、前中期から後期で観察された染色体、それぞれの形状を三次元的に明らかにすることができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1. 細胞の培養条件の検討：培養細胞としてインドホエジカ胸腺由来培養細胞を用いて通常培養液（F-10培地+10%FBS+P/S）で培養した。その後、微小管重合阻害剤であるコノダゾールを培地に加えて培養し、細胞分裂前中期に細胞分裂を同調させ、さらに通常培地で再培養することで前中期以降の各細胞分裂期の細胞を効率よく得るための培養条件の検討を行った。細胞分裂の同調では、ノコダゾールの濃度と処理時間、同調後の通常培地での再培養時間を検討、培養し、トリパンブルー染色液と血球計算盤と用いた光学顕微鏡観察で細胞生存率の確認、透過型電子顕微鏡観察でコダゾール処理による微細構造への影響についての検討を行い、細胞を細胞分裂前期、中期、後期、終期、それぞれの細胞が最も多く得られる細胞培養条件を決定した。
2. 各細胞分裂期の核膜と核内染色質または染色体の構造の解析：1の結果を元に各細胞分裂期の細胞を一般的な方法で化学固定し、樹脂包埋試料を作製した。資料ブロックから連続した準超薄切片を作製し、これら切片を走査型電子顕微鏡の反射電子モードで観察、画像を取得した。切片像から各分裂期の核膜、核内染色質または染色体の三次元再構築を行い、構造解析を行った。
よって本研究は概ね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度の実験結果から、当初の予定通り、通常の電子顕微鏡観察では細胞分裂前中期から後期までの細胞において核膜は観察されないことがわかった。今後は、免疫電子顕微鏡法による観察核膜に特異的に存在する蛋白質に対する免疫染色を行い、透過型電子顕微、走査型電子顕微鏡で観察を行い、細胞分裂前中期から後期の間の核膜の局在およびその動態変化について解析を行う。これにより、インドホエジカ胸腺由来培養細胞の体細胞分裂時の核に生じる一連の微細構造変化を明らかにすることができる。
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