2020 Fiscal Year Research-status Report
Analyses of the structure-function relationship based on the characteristic interaction among the intracellular domains in the hERG channel
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19K16491
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| Research Institution | Oita University |
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Principal Investigator |
粂 慎一郎 大分大学, 医学部, 助教 (90794579)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | イオンチャネル / hERGチャネル / 構造機能連関 / 分子生物学 / 電気生理学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
電位作動性カリウムチャネルファミリーに属するhERGチャネルは、電位センサードメイン（VSD）とポアドメイン（PD）が同じサブユニット間で相互作用するという、同ファミリーでは見られない独自の構造（Non-domain swapped構造）をとり、VSDとPDを細胞内で繋ぐS4-S5リンカードメイン（S4S5LD）とC末端細胞内のCリンカードメイン（CLD）との間に、この構造的特徴に伴う独自の相互作用が存在する。そして、このS4S5LDとCLDとの間に形成される相互作用は、hERGチャネルの特徴的な遅い脱活性化の制御機構への関与が示唆されるが、その詳細は未だに不明である。
本研究では、このS4S5LD-DLD間相互作用に焦点を当て、①相互作用に最も重要な部位（アミノ酸ペア）はどこか、②相互作用部位がチャネルの開閉状態に依存して構造変化するか、また、③遅い脱活性化の制御機構におけるこの相互作用の役割は何かを明らかにするべく、膜電位固定下でのシステイン（Cys）架橋形成実験を主とした分子生物学的・電気生理学的な実験・解析を計画している。
Cys架橋形成実験では、S4S5LDおよびCLDの両ドメインに存在する任意のアミノ酸をそれぞれCysに置換した二重変異体を作製し、人為的にジスルフィド結合（S-S結合）を形成させた際の影響を電流の変化としてパッチクランプ法により測定・解析する。本年度までに、これらの解析に使用する各種変異体の作製等の準備を完了し、現在は上記の①と②に関する解析に取り掛かっている。また、本計画の実験方法等を応用することにより、hERGチャネルにおける薬剤への影響に関する解析も実施し、これらの結果をまとめ、学術大会にて発表した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
本研究では、hERGチャネルの遅い脱活性化に関する構造機能連関の解明を目指し、特徴的なNon-domain swapped構造に伴う独自のS4S5LD-CLD間相互作用に焦点を当て、「研究実績の概要」で上述した①～③の解析を計画している。
当年度では、「研究実績の概要」で上述したように、解析に使用する各種変異体の作製、および、それらの変異体を使用するための最適な実験条件の検討等が完了した。その後、現在は①と②の解析に移行し、各種の結果が得られ始めている。
申請時の研究実施計画では、当年度内に①と②の解析を完了し、③に移行する予定であった。しかし、昨年度末に開催予定であった第97回日本生理学会大会の事務局員として、新型コロナウイルス感染症による大会中止の事後処理への対応や、同じくコロナ禍への対策としての対面授業の中止に伴う授業動画の作製など、当年度の数ヶ月間は持続的に実験を行えず、そのため①と②の解析の完了、また③への移行には至らなかった。
以上のような理由から、本研究における現在までの進捗状況は、申請時の研究実施計画から遅れていると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究は今後とも、hERGチャネル独自のS4S5LD-CLD間相互作用に焦点を当て、このチャネルの遅い脱活性化に関する構造機能連関の解明を目指す。
当年度の研究では、解析に使用する各種変異体の作製、および、それらの変異体を使用するための最適な実験条件の検討等が完了した。また、「研究実績の概要」で上述した、①相互作用に最も重要な部位（アミノ酸ペア）はどこか、および、②相互作用部位がチャネルの開閉状態に依存して構造変化するか、に関する解析に移行し、各種の結果が得られ始めた。今後は研究実施計画に基づき、①と②の解析を完了させ、また、③遅い脱活性化の制御機構におけるこの相互作用の役割は何かを解明すべく、本研究の遂行に向け尽力したい。また、得られた結果をまとめ、論文としての発表、または学術大会での発表を考えている。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額が生じた主な理由としては、「現在までの進捗状況」で上述したように、本研究における現在までの進捗状況が申請時の研究実施計画から遅れていることが挙げられる。当年度では、「研究実績の概要」で上述した①と②の解析へは移行できたが、その後の③の解析へは移行できなかったため、それらの解析において使用する予定であった物品・試薬等の購入に至らなかった。また、学術大会へ参加するための旅費として考えていた額については、コロナ禍の影響による学術大会のオンライン開催への移行に伴い、本年度中に使用することができなかった。以上のような理由により、次年度使用額が生じる結果となった。
ここで生じた次年度使用額に関しては、研究実施計画に基づき、今後の実験・解析のために使用する予定である。具体的には、当年度で実施できなかった③の解析を行う上で必要になる試薬や物品等の購入費、コロナ禍の収束により学術大会の会場での開催が可能になった際の旅費、および、論文として発表する場合はその費用として使用する予定である。
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