2019 Fiscal Year Research-status Report
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19K16516
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
浜口 知成 名古屋大学, 医学系研究科, 助教 (90812149)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 翻訳 / m7GTP cap / ストレス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
mRNAの5'末端にあるm7GTP capは、翻訳や輸送といったmRNA代謝に必須な化学修飾構造である。酸化ストレス下でのm7GTP capの役割は全く知られていない。mRNAの m7GTP capに酸化ストレス依存性に結合するタンパク質としてGEMIN4を同定した。最新のRNA-タンパク質相互作用解析法を用いて、GEMIN4の生体内結合RNAの次世代シークエンス解析を行ったところ、酸化ストレス依存性にリボソームタンパク質遺伝子を中心とする数千を超える遺伝子mRNAのm7GTP capに結合していた。また、レポーターアッセイでは、GEMIN4が酸化ストレス依存的に翻訳を抑制することが判明した。pulsed SILAC法（Stable Isotope Labeling using Amino acids in Cell culture)を用いて、GEMIN4が酸化ストレス依存的にリボソームタンパク質等の翻訳を抑制することが判明した。これらの実験から、酸化ストレスによってGEMIN4がm7GTP capと結合して翻訳を抑制することがわかった。m7GTP capとGEMIN4の結合にメチル化修飾が関与していることが、阻害剤を使った結合実験から明らかになった。現在、メチル化修飾部位を同定する実験を行なっている。質量分析を用いて、GEMIN4のリシンにおいてメチル化翻訳修飾部位を探索したが、有望なメチル化部位を同定できなかった。アルギニンのメチル化部位については取り組んでいる最中である。免疫染色を行ったところ、定常状態では細胞質に存在し、酸化ストレス刺激に伴い細胞質に凝集していく形態変化を認めた。これはストレス顆粒とは共局在しない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
pulsed SILAC法を用いて、m7GTP capとGEMIN4の結合がin vivoで翻訳抑制に関わることを示せた。そして、翻訳に関わる遺伝子を中心に抑制傾向を示していることが観察された。また、m7GTP capとGEMIN4の結合にメチル化修飾が関わっていることを示した。
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| Strategy for Future Research Activity |
m7GTP capとGEMIN4の結合に必要なメチル化修飾部位を同定する予定である。メチル化SILAC法および質量分析後のメチル化修飾解析を実施して、酸化ストレスによるアルギニンのメチル化修飾部位を探索する。
m7GTP capとGEMIN4の結合に他のタンパク質が関わっていないかを探索して、GEMIN4を中心とした複合体の存在を確認する。
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| Causes of Carryover |
今後も継続して、tRIPおよび質量分析を施行するため、試薬代およびシークエンス代として使用する予定でいる。具体的にはGEMIN4と複合体形成する別のタンパク質を探索することと、そのタンパク質がGEMIN4と同じようなRNA結合様式をするか探索することを計画している。
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