2020 Fiscal Year Research-status Report
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19K16516
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
浜口 知成 名古屋大学, 医学系研究科, 助教 (90812149)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | m7GTP / 翻訳 / ストレス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
mRNAの5'末端にあるm7GTP capは、翻訳や輸送といったmRNA代謝に必須な化学修飾構造である。酸化ストレス下でのm7GTP capの役割は全く知られていない。m7GTPに酸化ストレス依存性に結合するタンパク質としてGEMIN4を同定した。最新のRNA-タンパク質相互作用解析法を用いて、GEMIN4の生体内結合RNAの 次世代シークエンス解析を行ったところ、酸化ストレス依存性にリボソームタンパク質遺伝子を中心とする数千を超える遺伝子mRNAのm7GTP capに結合してい た。また、rRNAにも結合していた。レポーターアッセイでは、GEMIN4が酸化ストレス依存的に翻訳を抑制することが判明した。pulsed SILAC法(Stable Isotope Labeling using Amino acids in Cell culture)を用いて、GEMIN4が酸化ストレス依存的にリボソームタンパク質等の翻訳を抑制することが判明した。本年度、共同研究協力のもとRibosomal profilingを実施したが、翻訳抑制を支持するデータが得られなかった。しかし、この実験の改善余地が残されている。m7GTPとGEMIN4の結合にメチル化修飾が関与していることが、阻害剤を使った結合実験から明らかになった。タンパク質のメチル化修飾部位を同定する実験を行なったが、有望なメチル化部位を同定できなかった。免疫染色を行ったところ、GEMIN4は定常状態では細胞質に存在し、酸化ストレス刺激に伴い細胞質に凝集していく形態変化を認めた。しかし、これはストレス顆粒とは共局在しない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
これまでm7GTPとGEMIN4の相互作用が翻訳抑制機構に関わっているとの仮説のもと、実験を進めている。レポーターアッセー、pulsed SILACを用いた定量プロテオミクス、Ribosomal profiling、そしてPolysome fractionationを実施してきた。現状では、これらの結果を統合させると、翻訳抑制作用は強くはないと考えている。この相互作用がもたらす生物学的意義を考え直す必要があるかもしれない。
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| Strategy for Future Research Activity |
m7GTPとGEMIN4の相互作用が直接結合によるか、もしくは間接結合によるかを決定づける実験を予定している。具体的には、1. GEMIN4の精製タンパク質を哺乳類細胞から得る。2. in vitro transcriptionで得た合成RNAにm7GTP cappingを行い、m7GTP付加RNAを得る。 この２つの実験をヒ素刺激下で実施しながらGEMIN4とm7GTP付加RNAを得た上で、in vitro binding assayを実施する予定にする。
免疫染色を行ったところ、GEMIN4は定常状態では細胞質に存在し、酸化ストレス刺激に伴い細胞質に凝集していく形態変化を認めた。この凝集変化で収束していく顆粒がいったい何かを探索する実験を組んでいく。
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| Causes of Carryover |
次年度に新しい実験（タンパク質精製やRNA合成）を実施していく予定であるため、費用を集約しておくことにした。
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