2020 Fiscal Year Research-status Report
RNA結合タンパク質による抗線維化・抗炎症性miRNAの新たな産生阻害機構の解明
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19K16523
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Research Institution | Kochi University |
Principal Investigator |
樋口 琢磨 高知大学, 教育研究部医療学系基礎医学部門, 助教 (10754567)
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Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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Keywords | マイクロRNA / RNA結合タンパク質 |
Outline of Annual Research Achievements |
我々の研究チームではこれまで、二本鎖RNA結合タンパク質Nuclear Factor 90 (NF90)とその結合パートナーであるNF45の複合体(NF90-NF45)が、機能性小分子RNAであるマイクロRNA(miRNA)の生合成経路を負に制御することを報告してきた。一方で我々は、肝硬変や肝細胞がんへと進展する可能性のある非アルコール性脂肪肝炎(NASH)のモデルマウスの肝臓において、NF90およびNF45の発現が顕著に増加する事を見出している。さらに当該マウスの肝臓では抗線維化miRNAの一つであるmiR-483-5pの発現が低下していることから、NF90-NF45の発現増加が抗線維化miRNAの産生阻害を介してNASHの発症に寄与する可能性が示唆されている。本研究では、NASHの発症及びその後の肝硬変や肝細胞がんへの進展に対するNF90-NF45の影響を詳細に解析するため、ゲノム編集技術を用いて肝臓特異的NF90-NF45欠損マウスの作製を進めている。 今回、肝臓特異的NF90-NF45欠損マウス作製の前段階として、NF90 floxマウスの作製を実施した。CRISPR/Cas9法を用いてマウスNF90遺伝子の第4エクソン前後にloxP配列を導入した結果、目的のNF90 floxマウスを2系列得ることができた。本マウスを用いて、肝臓特異的NF90単独およびNF90-NF45欠損マウスの作製を進める予定である。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2019年度では、標的であるNF90遺伝子領域にloxP配列を2箇所挿入する手法として、長鎖の一本鎖DNAを用いた遺伝子改変を試みていたが、片側のみにloxP配列が挿入された個体や予期せぬ突然変異を有する個体しか得られていなかった。2020年度はNF90 floxマウスの作製計画を見直し、2箇所のloxP配列の挿入に対してそれぞれ短鎖の一本鎖DNAを用いて、ゲノム編集を実施した。その結果、目的領域にloxP配列が挿入されたNF90-floxマウスを2系列得ることができた。
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Strategy for Future Research Activity |
2020年度に得られたNF90 floxマウスと既に作製済みであるNF45 floxマウスと掛け合わせ、NF90-NF45 floxマウスを得る。その後、NF90-NF45 floxマウスと肝臓特異的Creリコンビナーゼ発現マウス(Albumin-Creマウス)を交配し、肝臓特異的NF90-NF45欠損マウスを作製する予定である。また、NF90 floxマウスとAlbumin-Creマウスを掛け合わせ、肝臓特異的NF90欠損マウスについても作製する。その後、得られた肝臓特異的NF90単独およびNF90-NF45欠損マウスに対してMCD食を給餌することで、NASHを発症させ、肝臓における線維化・炎症の進展に対するNF90およびNF90-NF45の影響を組織学的・生化学的解析により明らかにする。また、当該マウスの肝臓において、NF90-NF45が産生制御する抗線維化miRNAの候補であるmiR-483-5pの発現やmiR-483-5pの標的であるコラーゲン分解阻害因子Timp2の発現を解析する。以上の解析を通して、NF90-NF45の発現増加がmiRNAの産生制御を介して、NASHにおける肝線維化・炎症の進展に関与するか否かを検証していく。
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Research Products
(6 results)