2019 Fiscal Year Research-status Report
2型リアノジン受容体の組織特異的スプライシングバリアントの存在意義の解明
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19K16543
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| Research Institution | Nara Medical University |
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Principal Investigator |
牧野 舞 奈良県立医科大学, 医学部, 助教 (10736870)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | リアノジン受容体 / スプライシングバリアント / インスリン生合成 / カルシウムシグナル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
リアノジン受容体（RyR）は小胞体内腔から細胞質へのCa2+の放出を担うCa2+チャネルであり，膵β細胞ではインスリン生合成機構に関与している。主に心筋細胞に発現する2型RyR（RyR2）には組織特異的スプライシングバリアントが存在し，心筋型RyR2はexon 75を含むのに対し，膵β細胞型RyR2ではexon 75が欠失している。本研究では，ゲノム編集技術を用いてヒト膵β細胞由来培養細胞で発現するRyR2をexon 75を含む心筋型に改変させ，親株細胞とのインスリン生合成機能の差異を確かめることで，RyR2の組織特異的スプライシングバリアントの存在意義の解明を目指す。
まず，RyR2のintron 75のスプライスドナー配列が通常の「gt」ではなく「gg」であることによって選択的スプライシングが起こっていると考えられたため，ヒト膵β細胞由来1.1B4細胞に対してゲノム編集によってRyR2遺伝子の当該配列を「gt」へ点変異させ，exon 75を含むRyR2を発現するゲノム改変細胞を構築した。このゲノム改変細胞の培養上清中のインスリン分泌量をELISA法で，プロインスリンmRNA発現量をreal-time RT-PCR法で測定したところ，いずれも親株細胞と比較して著しく低下していた。一方，心筋型または膵β細胞型RyR2をコードするcDNAを組み込んだ発現ベクターをゲノム改変細胞へ導入しそれぞれの組換え体RyR2を発現させた結果，膵β細胞型RyR2 cDNAを導入したゲノム改変細胞でのみプロインスリンmRNA発現量の増加がみられた。したがって，RyR2のスプライス型（発現型）がexon 75欠失型であることが膵β細胞のインスリン生合成機能において重要な意味をもつことが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ヒト膵β細胞由来1.1B4細胞を用いてCRISPR/Cas9システムによりRyR2遺伝子のintron 75のスプライスドナー配列を「gg」から「gt」へホモ改変させた細胞を構築した。当該年度に計画したとおりに実験を遂行することができており，ゲノム改変細胞と親株細胞のインスリン生合成機能への影響を検証したところ，ゲノム改変細胞ではインスリン分泌量及びプロインスリンmRNA発現量が顕著に低下し，また，膵β細胞型RyR2 cDNAを導入し発現させるとプロインスリンmRNA発現量の増加がみられるという結果が得られた。
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| Strategy for Future Research Activity |
ヒト膵β細胞由来1.1B4細胞において，RyR2のスプライス型（発現型）が心筋型へ変化するとプロインスリンmRNA発現量が顕著に減少することが判明した。したがって，インスリン生合成機構においてRyR2はexon 75欠失型であることが重要であると考えられる。このように，当該年度までに得られた結果によって，RyR2のスプライス型の違いが細胞機能に大きく関係する可能性が示された。
今後の方策として，当初は，膵β細胞とは異なりexon 75を含む心筋型RyR2のみを発現している細胞（心筋細胞や血管平滑筋細胞など）におけるスプライシングバリアントの意義についても検証することを計画していた。しかし，RyR2の選択的スプライシングの重要性についてさらに理解を深めるためには，当該年度までに得られた培養細胞を用いたin vitroでの結果をさらに発展させて個体レベルのin vivoでの影響を検証する必要があると考えた。マウスのRyR2遺伝子のintron 75のスプライスドナー配列もヒトと同様に「gg」であるため，CRISPR/Cas9システムを用いてRyR2遺伝子のintron 75のスプライスドナー配列「gg」を「gt」に改変させたゲノム改変マウスを作製し，培養細胞レベルで確認されたインスリン生合成能の変化について個体レベルでの影響を検証することを計画した。現在，ゲノム改変マウス作製を進めており，作製したゲノム改変マウスに対しインスリン生合成機能の評価などを行うことを予定している。RyR2のexon 75の有無という選択的スプライシングの存在意義についてin vitro及びin vivoの両方での知見を研究成果としてまとめることを目指す。
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| Causes of Carryover |
当該年度に使用した試薬やキットなどの消耗品類は当初の計画よりも少なく済んだため，物品費に残金が生じた。また，当該年度では論文投稿・出版までに至らなかったため，英文校閲費として計画していた人件費及び論文投稿費・オープンアクセス費として計画していたその他の経費が未使用となった。
次年度はゲノム改変マウスの作製及び維持を計画しており，飼育費等を物品費より支出する予定である。また，研究成果を国内外の学術会議で発表するために必要な旅費や，学術論文の投稿に必要な英文校閲費，論文投稿費，オープンアクセス費を次年度に使用する予定である。
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Research Products
(2 results)
