2020 Fiscal Year Research-status Report
T. cruzi 感染刺激による宿主オートリソソーム形成抑制機構の解明
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19K16626
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
鬼塚 陽子 群馬大学, 大学院保健学研究科, 助教 (30710058)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | Trypanosoma cruzi / SNARE 複合体 / オートファジー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
クルーズトリパノソーマ (Trypanosoma cruzi, T. cruzi) は、中南米で流行しているシャーガス病の原因である細胞内寄生原虫である。この原虫の細胞内分裂増殖機構や病態形成メカニズムは明らかにされておらず、原虫は宿主防御反応に対する回避システムを有し、生き延びていると考えられる。宿主応答の一つとして細胞内タンパク質分解機構のオートファジーが挙げられ、この機構は小胞体から隔離膜が伸長し、不要物を包み込んだオートファゴソームを形成後、リソソームと融合することでオートリソソームとなり、内容物を加水分解する。これまでに、T. cruzi 感染細胞では、宿主オートファジーの初期過程は活性化しているが、オートファジーは完了せず、原虫は増殖・生存することを明らかにした。特にオートリソソーム形成が抑制されていることから、本研究ではオートリソソーム形成に関わるSNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive attachment protein receptor) 複合体(syntaxin17: stx17, Vesicle-associated membraneprotein 8: VAMP8, Synaptosomal-associated protein of 29 kDa: SNAP29) に焦点をあて、原虫感染による宿主オートリソソーム形成抑制機構を明らかにする。
昨年度行なったYeast two hybrid 法(Y2H)によるstx17 の相互作用因子探索では、宿主側因子のみ検出された。そこで2年度は、原虫感染細胞ライセートを用いたpull down assay を行い、相互作用因子を探索したところ、いくつかの原虫側因子が同定された。現在、同定された候補因子の解析を進めており、さらなる候補因子の探索を検討している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度中に、同定した候補因子のノックアウト(KO)原虫を樹立する予定だったが未だ至らず、本年度初頭はコロナ禍により、研究活動の制限を余儀なくされた。また、Y2H 法によるスクリーニングでは、宿主側因子のみ検出され、原虫側因子を同定できなかった。しかし、FLAG-stx17 HeLa 細胞にT. cruzi を9 時間感染させたライセートを用いたpull down assay を行い、LC-MS/MS 解析を行なったところ、複数の原虫側候補因子を同定できた。以上を踏まえ、やや遅れていると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
同定された原虫側候補因子に焦点を当て、申請内容に沿い実験を進める。データの正確性のため、再度pull down assay を行う。また、Y2H法による解析では宿主側因子のみ検出されたため、cDNA ライブラリー再構築が必要であると考え、改良後再度スクリーニングする。さらに、T. cruzi の候補因子の抗体を外注し、感染細胞内局在を調べつつ、KO 原虫の作製にも取り掛かる。樹立したKO 原虫を用いて、宿主細胞の感染率およびオートファジー関連分子の局在変化を解析し、その後感染マウスの病態変化について評価する。
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| Causes of Carryover |
参加予定であった学会がオンラインとなり旅費の未使用額が生じた。2年度の未使用額は、KO 原虫作製のための試薬、相互作用因子探索のための試薬購入やLC-MS/MS解析のための外注費に充てる。3年度経費の主な用途は消耗品・試薬で、内訳として細胞培養に必要な培地、血清、ディスポーザブルピペット等のプラスチック製品、抗体、遺伝子改変細胞用作製試薬などがあげられる。また、in vivo 実験用のマウスの購入が必要である。さらに、国内学会に参加し、研究成果を発表するための旅費も計上した。
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