2019 Fiscal Year Research-status Report
微生物間相互作用から紐解く多剤耐性菌由来β-ラクタマーゼの新機能
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19K16633
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| Research Institution | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology |
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Principal Investigator |
草田 裕之 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 研究員 (00827537)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 多剤耐性菌 / 抗生物質耐性 / 酵素 / 組換え大腸菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度は、分離培養化した多剤耐性菌からβ-ラクタマーゼをコードする候補遺伝子の選抜と組換えβ-ラクタマーゼ酵素の異宿主発現系の構築を実施した。具体的には、まず、抗生物質生産工場の排水処理システムから分離した多剤耐性菌群の全ゲノム情報をもとに、各種配列解析ツール（NCBI BLAST、Uniprot BLAT、InterproScan、Pfam等）を活用したドメインサーチとホモロジーサーチを実施し、β-ラクタマーゼ候補遺伝子の絞り込みを行った。その結果、既知のβ-ラクタマーゼに有意な相同性を示し、且つ本酵素ファミリーに特徴的な亜鉛結合モチーフ（Zinc-binding domain）を保持する候補配列を複数見出した。また、分子系統解析手法を用いて既知のβ-ラクタマーゼ酵素群と比較解析を実施し、候補配列の系統的位置や新規性を評価した。次に、選抜した各β-ラクタマーゼ候補遺伝子を遺伝子発現用のベクターにクローニングした発現ベクターを作製し、大腸菌を宿主とした組換えβ-ラクタマーゼ酵素の高発現系を構築した。組換えβ-ラクタマーゼ酵素はアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により酵素の純度を評価した。取得した精製酵素は酵素活性測定を進めており、一部の酵素に関しては至適温度や至適pHを明らかにした。今後、取得した組換え酵素の酵素活性測定を継続して行なっていく予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
現在までに、β-ラクタマーゼをコードする候補遺伝子を多剤耐性菌より見出すとともに、組換えβ-ラクタマーゼ酵素の異宿主発現系構築と精製酵素の取得に至っており、提案書に記載した通りに研究が進展している。また、精製酵素の活性測定および生化学的性質の解明にも着手している。以上の理由から、現在までの達成度は「おおむね順調」であると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、取得した精製酵素の酵素活性測定および生化学的諸性質の解明を引き続き推進していく予定である。また、アミノ酸の変異導入実験と変異体酵素の酵素活性測定を行うことで、β-ラクタマーゼの基質特異性決定メカニズムの解明を目指していく。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウィルスの影響により、参加予定であった学会が中止となり、また、在宅勤務のため予定していた外注分析が延期となったため、当該助成金（次年度使用額）が生じた。
新型コロナウィルスの感染拡大が終息したのち、本予算は翌年度分として請求した助成金と合わせて、外注分析の費用および学会参加のための旅費として予定通り使用する予定である。
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