微生物間相互作用から紐解く多剤耐性菌由来β-ラクタマーゼの新機能

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K16633
• Research Institution: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
• Principal Investigator: 草田 裕之 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 研究員 (00827537)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 多剤耐性菌 / 抗生物質耐性 / 酵素 / 組換え大腸菌

Outline of Annual Research Achievements

今年度は、昨年度に引き続き、β-ラクタム系抗生物質分解に関わる候補遺伝子を様々な細菌ゲノムから見出し、各種組換え酵素の異宿主発現系の構築および精製酵素の調整法を検討した。具体的には、選抜した候補遺伝子をそれぞれ遺伝子発現用のベクターにクローニングした遺伝子発現ベクターを作製し、タンパク質発現用大腸菌コンピテントセルで形質転換することで組換え酵素の高発現系を構築した。組換え酵素はNiアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、透析によるバッファー交換と限外濾過フィルターによる酵素の濃縮を行った後、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製酵素の純度を評価した。また、獲得した一部の精製酵素に関しては、酵素活性測定を実施するとともに、生化学的特徴（至適温度・至適pHなど）を明らかにした。
また今年度は、in silico解析にも注力し、獲得したβ-ラクタム系抗生物質分解酵素の系統や新規性、保存領域等の解析を実施した。まず、分子系統樹作成ツール用いて、獲得した酵素の分子系統学的解析を実施し、獲得した酵素の系統学的位置と新規性を明らかにした。また、遺伝情報処理ソフトウェアを用いて、配列データの各種解析（組成分析・プロモーター部位予測・等電点予測・二次構造予測など）を実施した。さらに、酵素の基質認識部位を推定するとともに、アミノ酸変異導入部位の設計にも着手しており、変異体酵素の解析準備を進めている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

これまでにβ-ラクタム系抗生物質分解に関わる候補遺伝子の異宿主発現系構築と精製酵素の獲得に成功している。さらに、今年度はin silico解析により、獲得した酵素の系統学的位置と新規性の評価や保存領域と基質認識部位の推定まで実施できており、提案書に記載した通りに研究を遂行できている。以上の理由から、現在までの達成度は「おおむね順調」であると判断した。

Strategy for Future Research Activity

今後の研究展開としては、獲得した各種酵素の酵素活性測定および生化学的諸性質の解明を引き続き推進していく計画である。また、各酵素の三次元立体構造モデリングや変異導入解析により、β-ラクタム系抗生物質分解酵素の基質特異性決定メカニズムの解明を目指していく。

Causes of Carryover

新型コロナウィルスの感染拡大の影響により在宅勤務の機会が増えたため、当初予定していた外注分析や生化学実験を延期したことで当該助成金（次年度使用額）が生じた。
新型コロナウィルスの感染拡大状況を注視しながら、本予算は翌年度分として請求した助成金と合わせて、外注分析および一般消耗品の費用として使用する予定である。