2021 Fiscal Year Research-status Report
皮膚糸状菌の低分子量Gタンパク質による菌糸形成および菌糸成長制御機構の解明
| Project/Area Number |
19K16656
|
|---|
| Research Institution | Musashino University |
|---|
Principal Investigator |
石井 雅樹 武蔵野大学, 薬学部, 助教 (10786966)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
|
| Keywords | 皮膚糸状菌 / Rhoファミリー低分子量Gタンパク質 / 病原性真菌 / 菌糸成長 / 細胞内シグナル伝達系 / 阻害剤スクリーニング / 生化学 / ケミカルバイオロジー |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
白癬（水虫）は皮膚糸状菌によって引き起こされる浅在性真菌感染症であり、１０人に１人が感染しているとも言われるほど一般的な疾患である。皮膚糸状菌の増殖形態である菌糸成長は皮膚糸状菌の病原性と深い関係にあるが、その分子機構については未だ不明な点が多い。本研究では、これまで皮膚糸状菌の菌糸成長との関与が知られていなかったRac様タンパク質およびそのGEFに着目し、皮膚糸状菌の菌糸成長への寄与を明らかにするとともに、医薬品開発における新規分子標的の同定を目指している。昨年度までに菌糸成長に関わるTrRac及びそのホモログTrCDC42変異株を作出し、菌糸成長への寄与を検討し、TrRac及びTrCDC42の遺伝学的な相互作用を見出しているほか、in vitroのアッセイ系で、TrCDC42及びTrRacがGEFによって活性化されることを示した。本年度はTrCDC42タンパク質の安定的な発現系の構築と、Rac及びCCDC42下流分子の探索を行なった。TrCDC42は、可溶化タグProS2の融合タンパク質として発現させることで、活性を保持し、安定的に発現することが可能であった。また、下流分子としてp21-activated kinaseの欠損株を作出し、菌糸成長が抑制されることを見出した。以上のことから、TrRac及びTrCDC42を中心とした皮膚糸状菌の菌糸成長を制御する細胞内シグナル伝達系を明らかにし、GEFによるTrRac及びTrCDC42の活性化とそれに続くキナーゼの活性化が新奇抗真菌薬の創薬標的となることを提案する。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初予定していた研究計画で、A.皮膚糸状菌のRac様タンパク質の生理的機能の解明及びB.皮膚糸状菌のRac様タンパク質の相互作用因子の同定と薬剤スクリーニングを見据えたアッセイ系の確立の二点を進める予定でいた。本年度は、それらの検討のうち、A.について予定されていたRac様タンパク質の下流分子の解析を推進した。TrRacの下流分子候補として、複数のタンパク質が挙げられたが、その中でもRacとの結合に関与するCRIB(CDC42/Rac interactive binding)ドメインを有するタンパク質PAK(p21-activated kinase)に着目し、その欠損株を複数作出した。結果、一つの欠損株で菌糸成長の極端な遅延が見られたことから、PAKが皮膚糸状菌の菌糸成長に寄与することを見出した。これらのことから、昨年度の結果と加えて、当初の計画で予定していた研究の深部まで研究を進めることに成功した。また、Bについては、TrCDC42について大腸菌による安定的な発現系の構築を目指し、比較的容易にタンパク質を可溶化状態で発現させる手法を確立した。現在、更なる大量発現に向け培養条件等のブラッシュアップをおこなっている。また、Aの検討で見出されたTrRacの下流タンパク質PAKについてもタンパク質発現系を構築中である。
|
| Strategy for Future Research Activity |
令和4年度の推進方策として、GEF、TrRac及びTrCDC42変異株について免疫染色法などの手法を用いて細胞内タンパク質動態への影響特にアクチンなどの細胞骨格の局在を検討することで菌糸成長制御機構の分子機構の解明を進展させる。さらに、創薬基盤の構築に向けては、GEFによるTrRac及びTrCDC42の活性化及びその下流分子の活性を検出するハイスループットスクリーニング系の確立を目指し、安定的な発現が可能となったTrCDC42の大量発現の検討や、ハイスループット系で使用する液体容量、タンパク質の用量、及び反応液の組成などについて条件検討を行っていく他、PAKタンパク質の発現系の検討も進めていく。さらに、本研究課題の公表を目的として、学会発表及び論文化を進める。
|
| Causes of Carryover |
COVID19感染症に伴う緊急事態宣言等による研究施設への部分的な立ち入り制限や物品の納入の遅延等により、実験施設における研究を十全に行えない期間があったため、執行額が予定より少なかった。次年度の感染症の動向は見えないが、可能な部分では引き続き外部受注等も使用しつつ研究を遂行していく予定である。計画としてはタンパク質の大量発現系の構築、アッセイ系の構築を行う予定であり、早期の物品発注、外部受注による構築ずみタグ入りベクターの購入等を利用し、研究を推進する。
|
Research Products
(6 results)
