肺炎クラミジア遺伝子機能解析の為の遺伝子破壊株ライブラリの作製

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K16660
• Research Institution: Fukuoka University
• Principal Investigator: 清水 章文 福岡大学, 医学部, 講師 (40780135)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 肺炎クラミジア / グループIIイントロン / 遺伝子改変 / プラスミドベクター

Outline of Annual Research Achievements

肺炎クラミジアにおける遺伝子破壊株ライブラリの作製を目的として、肺炎クラミジア遺伝子破壊用のプラスミドベクターの作製を行ってきた。昨年度は樹立した遺伝子破壊用プラスミドベクターの機能確認を実施するとともに、遺伝子破壊を実施する肺炎クラミジア遺伝子リストを作成してそれらの遺伝子破壊用プラスミドベクターライブラリの作製を実施する計画であった。
現在、目的とする遺伝子破壊用プラスミドベクターと遺伝子再導入用プラスミドベクターの作製が進み、目的とするプラスミドベクターの作製が完了している。
そのプラスミドベクターが目的通りに機能するかについて電気穿孔法による形質導入を試みた。遺伝子破壊用プラスミドベクターについて、機能既知の肺炎クラミジア遺伝子incAを破壊する遺伝子破壊ベクターを作製し、形質転換を実施した。その際、使用する肺炎クラミジアの血清型としては、本研究で予定していた血清型AR-39株から血清型CWL092株へと変更している。変更の理由としては、肺炎クラミジアの血清型AR-39株は溶原化バクテリオファージを保有しており、遺伝学的実験におけるバイアスとなりかねない為溶原化バクテリオファージを保有していない血清型CWL029株を用いることとした。電気穿孔法による導入の後に実施する選択培養において、β-ラクタマーゼ遺伝子及びクロラムフェニコールアセチル基転移酵素の2種類どちらかを導入し、ペニシリンG終濃度10U/ml、もしくはクロラムフェニコール終濃度2μg/mlを添加して培養している。現在までに形質転換後５継代以降の時点において薬剤選択培養後に生存する肺炎クラミジアクローンは得られていない。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

昨年度までの実験によって目的とする遺伝子破壊用プラスミドベクターの構築は完了していた。遺伝子破壊後の遺伝子再導入の為に、クラミジア由来プラスミドと大腸菌プラスミドベクターとをライゲーションすることによって遺伝子再導入用プラスミドベクターの作製を実施した。
これらのプラスミドベクターについて、分注し冷凍保存しているが、精製時の確認に用いた同じ制限酵素の組み合わせで消化し再確認したところ、冷凍保存時のプラスミドDNA配列とは異なっていることが分かった。可能性として考えられるものとして、このプラスミドベクターに利用しているグループIIイントロンが自己スプライシング反応性のある配列であることから、精製済みプラスミドDNA単体で保存した場合に一定期間を経ると自己スプライシング反応によりプラスミドDNAが変質してしまったことが考えられた。
これらのプラスミドベクターは液体窒素気相中に保存した大腸菌ストック内のものについては配列が保持されていたため、今後の保存を精製プラスミドDNAもしくは大腸菌ストックとして-80℃以下の低温で保存することにより対処していく。

Strategy for Future Research Activity

今回用いている遺伝子改変ベクターとしてのプラスミドDNAに自己スプライシング反応による変質性が確認されたため、プラスミドDNA精製後直ちに電気穿孔法による形質転換を試みることにより遺伝子破壊が可能であるかについて調べる。また、この遺伝子破壊ベクターが肺炎クラミジアにおける遺伝子破壊ライブラリの作製に寄与可能であるかについて解析を進めたい。

Causes of Carryover

執行しなかった機器購入の余剰金及びコロナ禍における研究遂行遅延により研究計画を延長している。
今後の新たなプラスミドベクター構築、形質転換、使用する肺炎クラミジア株の購入、免疫学的解析試薬購入経費などへ充てることにより遅延している研究を進める予定である。