2019 Fiscal Year Research-status Report
結核菌RND型異物排出システムによる潜在的多剤耐性機構の解明
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19K16662
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| Research Institution | National Institute of Infectious Diseases |
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Principal Investigator |
山本 健太郎 国立感染症研究所, ハンセン病研究センター 感染制御部, 研究員 (40832308)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 結核 / 薬剤耐性 / 生物物理学 / 抗酸菌 / バイオイメージング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
結核菌RNDトランスポーターMmpL5とMmpL7のGFP融合タンパク質を発現するintegration plasmidを構築した．さらに，これらの上流に膜融合タンパク質MmpS5を組み込んだプラスミドもそれぞれ構築した．また，融合タンパク質発現株として，M. bovis BCGを親株としたmmpS5-L5欠失株を構築した．この株に各プラスミドを移入し，薬剤耐性能を調べたところ，MmpS5-L5発現時のみ抗結核薬であるベダキリン，クロファジミンに耐性を示した．
次に，これらの組換え体を全反射蛍光顕微鏡により観察した．すると，MmpL5-GFPはMmpS5の存在下では細胞膜上に固定されるが，非存在下では自由拡散する様子が観察された．一方で，元々ペアとなる膜融合タンパク質をゲノム上に持っていないMmpL7はMmpS5の有無に関わらず細胞膜上に固定された．さらに，固定されたGFP輝点に対して蛍光退色をモニターすることで，これらの輝点がGFP３分子分に相当することがわかった．一方，動く輝点はGFP１分子分の輝度を示した．これらのことから，膜融合タンパク質によりMmpL5,MmpL7は細胞膜に固定され，三量体形成を促進することが示唆された．MmpL5はMmpS5非存在下では薬剤排出能を示さないことから，抗酸菌のRNDトランスポーターの活性化には細胞膜への固定と，三量体形成がキーになると予想される．MmpS5がMmpL5をアンカーする対象は，細胞膜に直接，もしくは一般的に知られるRND型排出ポンプのように外膜チャネルである可能性が高い．結核菌における，この外膜チャネルの存在は未だ予測でしかないが，本研究により対象を絞り込める可能性もある．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
MIC測定とウエスタンブロッティングによりGFP融合によるMmpL5の機能阻害や，リンカー部分での切断が確認されなかったため，融合タンパク質の再設計などが不要であった．また，全反射蛍光顕微鏡による抗酸菌の観察も知見がなかったものの，非常に高精度にデータを取得できた．さらなるデータの蓄積は必要であるものの，研究計画自体は概ね当初の予定通り進展しているといえる．
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| Strategy for Future Research Activity |
MmpL5はMmpS5の存在下により，機能の活性化と細胞膜への固定が行われると考えられた．このことを裏付けるため，MmpS5とMmpL5の直接的な結合をモニターしたい．これにはMmpS5特異的な抗体を作製し，蛍光免疫染色による共局在観察を試みる．また，MmpS5の欠失が細胞膜そのものの構造，流動性に影響を与えている可能性も無視できない．そこで，各タンパク質発現下の菌体を透過型電子顕微鏡による観察を行い，細胞膜，細胞壁等のエンベロープ構造に影響がないか調べる．
MmpL7はペアとなる膜融合タンパク質が見つかっていないものの，MmpS5非存在下でも細胞膜上に固定されている．ゲノム上にコードされるMmpSは１～５まで５種類存在するため，残りの４種の内のいずれかがMmpL7とペアをなす可能性は高い．これらの欠失株を構築し，同様に観察することでMmpL7のペアを探し出せるかもしれない．
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| Causes of Carryover |
プラスミドや菌株の構築などの検討が複数回に及ばなかったため，余剰金が生じた．
この余剰分は次年度に執筆予定の論文の投稿費用，英文校正費用などに充てる．
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