2020 Fiscal Year Research-status Report
結核菌RND型異物排出システムによる潜在的多剤耐性機構の解明
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19K16662
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| Research Institution | National Institute of Infectious Diseases |
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Principal Investigator |
山本 健太郎 国立感染症研究所, ハンセン病研究センター 感染制御部, 研究員 (40832308)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 結核 / 薬剤耐性 / 生物物理学 / 抗酸菌 / バイオイメージング / 一分子観察 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度は結核菌RNDトランスポーターMmpL5が膜融合タンパク質MmpS5存在化で細胞膜上に固定され，また，トランスポーターモノマーが三量体を形成し薬剤耐性能を獲得することを見出した。
今年度では，まず，MmpS5の欠失により細胞膜，もしくは細胞壁に構造的・性質的な変化が起きていないかを検討した。具体的には野生型のM. bovis BCG株とMmpS5非存在株，MmpSL5非存在株を透過型電子顕微鏡 (TEM)を使って構造を観察した。その結果，これらの菌株間で細胞壁等の細胞構造に有意な違いは認められなかった。次に，細胞膜の透過性を調べるため，上記の３つの菌株を使ってエチジウムブロマイドの細胞膜透過性を測定した。細胞内に蓄積したエチジウムブロマイドの培地中への流出を分光光度計によりモニターした結果，各菌株間で違いは見られなかった。これらのことからMmpS5欠失は細胞膜や細胞壁に構造的な影響を与えておらず，MmpL5の動態はMmpS5の直接的，もしくは間接的な相互作用がコントロールしていると考えられる。
さらに，MmpS5とMmpL5の共局在を確かめるために抗MmpS5ウサギ抗体を作成した。作成した抗体を用いて，MmpL5-GFP発現株のMmpS5に対する免疫染色を行い，蛍光顕微鏡による観察を試みた。しかしながら，抗MmpS5による非特異的染色が目的シグナルを阻害し，MmpS5とMmpL5の共局在を証明するに足るデータを得ることはできなかった。
昨年度までの結果をまとめ，査読付き英文誌に論文を投稿し掲載された。
DOI: 10.1128/mSphere.00518-20
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
共局在の観察は上手く行かなかったものの，mmpS5欠失による細部構造の変化等がないことを速やかに確認できた。また，ここまでのデータを用いて論文をまとめ，投稿・掲載することができた。以上のことより，助成期間の半分が終了した時点で研究計画の半分が終了しており十分に当初の計画を達成していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
論文を投稿したが，MmpS5とMmpL5の直接的な結合を証明できていない。これを証明するためにMmpS5とMmpL5を精製し，構造を決定する計画を進めている。具体的には，精製タンパク質をCryo-EMを用いてMmpS5-MmpL5の結合を観察する。また，同様の方法により，MmPL5への薬剤（基質）の結合を観察したいと考えている。
また，当初の計画通りルシフェラーゼベクターを用いた二成分制御系によるMmpSL5発現制御機構の仕組みを調べる。
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| Causes of Carryover |
コロナ禍であったために出張費や学会参加費が発生しなかったことにより大幅に繰越金が生じた。
翌年度のオンライン学会参加費や新規に計画しているCryo-EMの使用料などに当該金を使用する予定である。
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