宿主プロテインキナーゼによるB型肝炎ウイルス侵入制御機構の解明

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K16672
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 岩本 将士 九州大学, 理学研究院, 学術研究員 (40825882)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: HBV / プロテインキナーゼ / EGFR

Outline of Annual Research Achievements

B型肝炎ウイルス（HBV）が宿主へ感染するためにはウイルス受容体NTCPへ結合する必要がある。しかし、NTCP吸着後の細胞内侵入過程を制御する宿主機構はほとんど明らかとなっていなかった。本研究ではチロシンキナーゼ型受容体EGFRがHBV細胞内侵入(内在化)を制御する宿主プロテインキナーゼであることを明らかにした。siRNAを用いてEGFRをノックダウンした細胞ではHBV感染が大きく減少した。この細胞ではHBVの細胞表面への吸着は変化がなかった一方で、内在化が大きく低下した。EGFRのリガンドであるEGFの細胞への処理によりHBV感染は上昇した。この時、HBVエンベロープを模倣したペオプチド( preS1)とNTCPおよびEGFRが共に内在化する様子が観察された。免疫沈降法によりEGFRはNTCPと相互作用することを明らかにした。HBVはこれらNTCP-EGFR相互作用を介して細胞内への侵入を果たしており、この相互作用の阻害によりHBV感染が低下した。これら結果はEGFRがHBV内在化を制御する宿主因子であることを示す。
EGFRはリガンドとの結合によりプロテインキナーゼ活性を示す。変異体解析によりプロテインキナーゼ活性不活型変異体EGFRではHBV感染を補助できなかった。これはEGFRの活性化がHBV感染に必要であることを示唆する。EGFRは自身のプロテインキナーゼ活性により下流シグナル経路の活性化およびEGFR自身のエンドサイトーシスを誘導する。EGFR下流シグナルの阻害剤処理ではHBV感染に影響がなかった一方で、エンドサイトーシス活性を不活型にした変異体EGFRではHBV感染を補助しなかった。これら結果はHBVがEGFRエンドサイトーシス経路を利用して細胞内へと侵入することを示唆する。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

申請者のこれまでの研究により、EGFRはHBV内在化に必須な宿主プロテインキナーゼであることを示した。EGFRプロテインキナーゼはHBV感染に必要であり、EGFRエンドサイトーシス経路依存的な細胞内侵入を果たしていることを明らかにした。今年度ではこれら結果を学術論文として投稿し受理されたことからも本課題は順調に進行していると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

本年度ではHBV内在化を制御する宿主因子とその制御機構を明らかにした。EGFRはHBV内在化だけでなく、その後の細胞内輸送にも関わる可能性を示唆する予備データを得ていることより、HBV細胞内輸送制御機構の解析を今後推し進める。また本研究よりEGFRを含むプロテインキナーゼ阻害剤がHBV感染阻害効果を発揮すると期待されるため、 これらの抗ウイルス活性を評価し新しい創薬標的を提案する。

Causes of Carryover

本年度の研究が効率的に進み直接経費が節約できた。次年度ではHBV細胞内輸送制御機構を効率的に解析するための新たな実験系を構築する必要が生じ、関連する試験およびまとまった試薬の購入を次年度に行うこととしたため、本年度の研究費の一部を次年度へと繰り越した。
次年度も引き続き培養細胞へのHBV感染実験系を用いた解析を主に行う。これらの実験のために、一般試薬、培養試薬、トランスフェクション試薬、プラスチック器具、タンパク質実験試薬、RNA関連実験試薬などの購入費が必要である。また共同研究者との研究打ち合わせのための旅費や、得られた研究成果を学会および学術雑誌などで発表するための費用を計上する。

Research Products

• [Journal Article] The machinery for endocytosis of epidermal growth factor receptor coordinates the transport of incoming hepatitis B virus to the endosomal network. (2020)
  • Author(s): Iwamoto M, Saso W, Nishioka K, Ohashi H, Sugiyama R, Ryo A, Ohki M, Yun JH, Park SY, Ohshima T, Suzuki R, Aizaki H, Muramatsu M, Matano T, Iwami S, Sureau C, Wakita T, Watashi K
  • Journal Title: J Biol Chem Volume: 295 Pages: 800-807
  • DOI: 10.1074/jbc.AC119.010366
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Epidermal growth factor receptor is a host entry cofactor triggering hepatitis B virus internalization. (2019)
  • Author(s): M. Iwamoto, W. Saso, R. Sugiyama, K. Ishii, M. Ohki, S. Nagamori, R. Suzuki, H. Aizaki, A. Ryo, J-H Yun, S-Y Park, N. Ohtani, M. Muramatsu, S. Iwami, Y. Tanaka, C. Sureau, T. Wakita and K. Watashi
  • Journal Title: Proc. Natl. Acad. Sci. USA Volume: 116 Pages: 8487-8492
  • DOI: 10.1073/pnas.1811064116
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Anti-viral effects of interferon-λ3 on hepatitis B virus infection in cell culture. (2019)
  • Author(s): Yamada N, Murayama A, Shiina M, Aly HH, Iwamoto M, Tsukuda S, Watashi K, Tanaka T, Moriishi K, Nishitsuji H, Sugiyama M, Mizokami M, Shimotohno K, Muramatsu M, Murata K, Kato T
  • Journal Title: Hepatol Res Volume: 50 Pages: 283-291
  • DOI: 10.1111/hepr.13449
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Synthesis of nucleotide analogues, EFdA, EdA and EdAP, and the effect of EdAP on hepatitis B virus replication (2019)
  • Author(s): Kamata M, Takeuchi T, Hayashi E, Nishioka K, Oshima M, Iwamoto M, Nishiuchi K, Kamo S, Tomoshige S, Watashi K, Kamisuki S, Ohrui H, Sugawara F, Kuramochi K
  • Journal Title: Biosci Biotechnol Biochem Volume: 84 Pages: 217-227
  • DOI: 10.1080/09168451.2019.1673696
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Epidermal growth factor receptor as a novel host entry cofactor that triggers hepatitis B virus internalization. (2019)
  • Author(s): Masashi Iwamoto, Wakana Saso, Mio Ohki, Ryosuke Suzuki, Hideki Aizaki, Akihide Ryo, Sam-Yong Park, Masamichi Muramatsu, Shingo Iwami, Yasuhito Tanaka, Camille Sureau, Takaji Wakita, Koichi Watashi
  • Organizer: 2019 International Meeting on Molecular Biology of Hepatitis B Viruses
  • Int'l Joint Research