2019 Fiscal Year Research-status Report
DNAメチル化をターゲットとした新しい乳癌治療の試み
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19K16681
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
應田 涼太 北海道大学, 医学研究院, 助教 (90817321)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | MHC-I / NLRC5 / 遺伝子特異的脱メチル化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまで我々の研究グループはMHC class I 遺伝子群のマスター転写因子としてNLRC5を同定し、 NLRC5がCD8+T細胞を介した腫瘍免疫において重要な役割を果たしていることを明らかとした。一方、多くの予後不良乳癌患者においてはNLRC5遺伝子が高度にメチル化しNLRC5の発現が低下していた。これらはNLRC5が癌治療の有力なターゲットである事を示唆している。既存の脱メチル化剤は非特異的であるため強い副作用を有し、一部の癌にしか用いることができない。そのため、特異的なDNA脱メチル化技術の開発が長く望まれていた。本研究は、CRISPR/Cas9システムを応用した新しい特異的脱メチル化技術の開発を行うことにより、新しい癌治療戦略の可能性を明らかにすることが目的である。
本助成における研究実績として、ヒト乳癌細胞であるMCF7に脱メチル化剤である5-Azacytudune(5-Aza)を処理したところNLRC5の発現量が増加し、MHC-I関連遺伝子の発現増加も観察出来た。この結果は、癌細胞ではNLRC5プロモーター領域のメチル化によってNLRC5の発現、MHC-I関連遺伝子の発現が抑制されているという我々の仮説を裏付けるものである。次に、NLRC5遺伝子特異的脱メチル化を行うために脱メチル化酵素であるTET1と酵素活性を欠損させたCas9(dCas9)を融合させた発現ベクター(dCas9-TET1)を作製した。また、レンチウイルスを用いてdCas9-TET1安定発現MCF7細胞の作製に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本助成は、CRISPR/Cas9技術の改変を用いて遺伝子特異的な脱メチル化を達成することを目的としている。
脱メチル化剤である5-Azacytudune(5-Aza)を処理を行うことによってNLRC5の発現量が増加し、MHC-I関連遺伝子の発現増加も観察出来、癌細胞ではNLRC5プロモーター領域のメチル化によってNLRC5の発現、MHC-I関連遺伝子の発現が抑制されているという我々の仮説を裏付けることが出来た。
また本年度において目標としていた、脱メチル化酵素であるTET1と酵素活性を欠損させたCas9(dCas9)を融合させた発現ベクター(dCas9-TET1)の作製とdCas9-TET1安定発現MCF7細胞の作製に成功したことから概ね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度において、dCas9-TET1安定発現MCF7細胞の作製に成功した。今後は、dCas9-TET1安定発現MCF7細胞にNLRC5プロモーター領域特異的なgRNAを設計し、導入する。脱メチル化レベルはバイサルファイトシークエンスで確認し、NLRC5、MHC-I関連遺伝子の発現量はqPCRで測定する。
また、in vivoにおけるNLRC5脱メチル化と癌増殖を検討するために、マウス乳癌細胞株（E0771）を同系のC57BL/6マウスに移植し、エピゲノム編集レンチウイルスを隔日ごとに腫瘍内に経皮投与し、腫瘍内CD8+T細胞数、活性度、腫瘍サイズ、生存曲線を求める。
また、免疫チェックポイント阻害剤の治療効果はCD8+T細胞の活性化に依存することから、我々の予備実験データから推測するに不応症例のかなりの割合がNLRC5の発現または機能不全によるものである可能性がある。そこで、上記の乳癌モデルマウスをエピゲノム編集によってNLRC5の脱メチル化を行うと同時に免疫チェックポイント阻害剤で治療し、治療効果を腫瘍内CD8+T細胞数、活性度、腫瘍サイズ、生存率によって評価する。本研究から、エピゲノム編集によるNLRC5 DNA脱メチル化を行うことにより免疫チェックポイント阻害剤の治療効果拡大に繋がることが期待出来る。
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