DNAメチル化をターゲットとした新しい乳癌治療の試み

2021 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19K16681
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 應田 涼太 北海道大学, 医学研究院, 助教 (90817321)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: MHC-I / NLRC5 / 遺伝子特異的脱メチル化

Outline of Annual Research Achievements

これまで我々の研究から、乳癌患者の5年生存率とNLRC5遺伝子発現量が相関し、NLRC5遺伝子のメチル化度と逆相関することが明らかとなった。そこでNLRC5を標的遺伝子として、マウス乳癌細胞株（E0771）にてCRISPR/Cas9システムを応用した遺伝子特異的脱メチル化技術開発を行った。具体的には、①酵素活性能を欠損させたCas9 (dCas9)と脱メチル化酵素TET1を融合させた発現ベクター (dCas9-TET1) ②遺伝子特異的なガイドRNA発現ベクター (sgRNA) ③sgRNA特異的に結合するバクテリオファージ由来MS2 coat proteinと脱メチル化酵素TET1を融合させた発現ベクター (MS2-TET1)を作製した。上記の脱メチル化誘導発現ベクターを用いてNLRC5の発現量をqPCRによって測定し、脱メチル化割合はバイサルファイトシークエンス法によって検討を行った。その結果、gRNAを導入することによってNLRC5発現量の上昇が見られ、NLRC5遺伝子プロモーター上に存在するメチル化領域(CpG1)において、脱メチル化が確認された。また、dCas9技術を改変し、更なるNLRC5発現誘導を目指した。具体的には、脱メチル化酵素(TET1)にNLRC5の転写因子であるp65を付け加えた融合タンパク質(TET1-p65)を作成し、NLRC5遺伝子を標的としたgRNAによってTET1-p65をNLRC5プロモーター領域に送り込んだ。その結果、脱メチル化酵素(TET1)単独を送り込んだ場合より、転写因子融合脱メチル化酵素(TET1-p65)を送り込むことによってNLRC5発現量の更なる増加が見られ、またMHC-I関連遺伝子であるLMP2の発現量の上昇も得られた