2019 Fiscal Year Research-status Report
癌幹細胞の腫瘍抗原性調節による大腸癌免疫療法の検討
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19K16712
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
中西 祐貴 京都大学, 医学研究科, 特定助教 (40838679)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 大腸癌 / 癌免疫療法 / 癌幹細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
大腸がんは、本邦のがん罹患の第１位、がん死の第２位を占める。近年注目される癌免疫療法は複数の癌腫において有効性が確認されているが、大腸癌においてはごく一部の症例でしか奏功せず、治療抵抗性メカニズムの解明および新規治療ストラテジーの樹立が強く期待されている。
一方、癌幹細胞は癌の発生・維持に加えて浸潤や転移などに関与しているとされている。また近年、大腸癌幹細胞が肝転移巣形成に主たる役割を果たすことが示されている。本研究では、癌幹細胞が免疫原性を調節して、抗腫瘍免疫を抑制している可能性を考慮し、大腸癌オルガノイドの直腸移植および脾臓移植による転移モデルを用いて、癌幹細胞における免疫原性調節機構に迫る。
具体的には、１）大腸癌幹細胞に発現し、免疫原性を調節する因子の同定、２）１）で同定された分子の機能解析、３）腫瘍免疫原性の調節による大腸癌免疫療法への応用を検討する。そのために令和元年度はまず、（１）腸管における癌幹細胞特異的因子の網羅的同定を行った。当研究室では以前、大腸癌幹細胞マーカーとして報告したDclk1およびIL17RBのプロモーター下にcreERT2-EGFPを導入したマウスをApcMinマウスと交配し、Dclk1/IL17RBおよび他の幹細胞マーカーが高発現している腫瘍細胞のマイクロアレイ解析を行っている。癌幹細胞特異的な因子を絞り込み、癌免疫原性に関与していると考えられる因子Xを同定した。また興味深いことに、癌幹細胞がenrichされた癌オルガノイドにおいて、因子Xが高発現しており、かつ高い肝転移能を有することを確認した。さらに、２）因子XをCRISPR/CAS9遺伝子編集技術を用いて、大腸癌オルガノイドでノックアウトするべく、sgRNAコンストラクトを作成し、レンチウイルスベクターを用いてオルガノイドに導入。現在、クローン選別と進捗している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、癌幹細胞が免疫原性を調節して、抗腫瘍免疫を抑制している可能性を考慮し、１）大腸癌幹細胞に発現し、免疫原性を調節する因子の同定、２）１）で同定された分子の機能解析を行い、３）腫瘍免疫原性の調節による大腸癌免疫療法への応用への展開を予定していた。令和元年度は、１）当研究室の以前のマイクロアレイ解析データを用いて、Dclk1陽性癌幹細胞特異的な因子であり、かつ腫瘍免疫原性にも関与していると考えられる因子Xを同定することができた。また、癌幹細胞がenrichされた大腸癌オルガノイドにおいて、因子Xが高発現しており、かつリンパ節や肝に高い転移能を有することも確認できた。さらに、２）因子XをCRISPR/CAS9遺伝子編集技術を用いて、大腸癌オルガノイドでノックアウトするべく、sgRNAコンストラクトを作成し、レンチウイルスベクターを用いてオルガノイドに導入する過程に進捗することができた。現在、クローン選別を行なっている途中であり、早晩樹立可能と考えられる。したがって、当初計画のタイムテーブルに沿うかたちで、研究はおおむね順調に進展しているものと考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和元年度の研究進展により１）大腸癌幹細胞に発現し、免疫原性を調節する因子は既に同定できている。２）１）で同定された分子Xの機能解析のために、大腸癌オルガノイドにおいて、分子Xのノックアウトを進め完遂する。さらに、既に手中にある、癌幹細胞およびXが高発現され、かつ転移能が高い大腸癌オルガノイドにおいてもXをノックアウトすることで、癌
幹細胞の免疫原性におけるXの役割の検討を完遂させる。さらにその後、３）分子Xのノックアウトを免疫チェックポイント阻害剤と併用し、腫瘍免疫原性の調節による免疫療法の有効性検討を行う。同実験の結果に基づき、ヒト癌オルガノイドを用いた検討も行う。これら一連の研究を通じて、癌幹細胞がいかに免疫原性を低下させ宿主免疫系からの攻撃を避けているかを明らかにすると共に、癌幹細胞の免疫原性を回復させることで、癌免疫療法の効果を上昇させうるかに迫る。
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| Causes of Carryover |
次年度は、既に同定した癌幹細胞で高発現する因子Xのノックアウトを進める。また、癌幹細胞およびXが高発現され、かつ転移能が高い大腸癌オルガノイドにおいてもXをノックアウトすることで、癌幹細胞の免疫原性におけるXの役割の検討していく。さらにその後、分子Xのノックアウトを免疫チェックポイント阻害剤（抗PD-1/PD-L1抗体）と併用し、腫瘍免疫原性の調節による免疫療法の有効性検討in vivoで行う。同実験の結果に基づき、ヒト癌オルガノイドを用いて同様の検討も行う。これら一連の研究の一部は、令和元年度に着手する予定であったが、COVID-19感染問題に伴い、海外の共同研究者からのマテリアルの輸送遅延などにともない、次年度にずれ込んだため、より多くの支出が次年度に必要となる。
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