2021 Fiscal Year Research-status Report
Epigenomic analysis of the induction of apoptosis
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19K16726
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| Research Institution | Fukuoka Dental College |
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Principal Investigator |
武石 幸容 福岡歯科大学, 口腔歯学部, 助教 (00758055)
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2020-03-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 上皮間葉転換 / クロマチン動態 / 口腔癌 / アクチン / ChIP-Seq |
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| Outline of Annual Research Achievements |
上皮間葉転換(EMT)を促進する増殖因子 TGF-βによってEMTを誘導し、EMT誘導前後のクロマチン動態の変化をエピゲノムの手法を用いて解析する。そのため正常細胞と癌細胞を用いてEMTの誘導が起こることを確認した。
正常細胞として用いるヒト表皮角化細胞株 HaCaT細胞(HaCaT)は、既にEMTに関する報告が出ている。実際、培地にTGF-βの添加し48時間後に観察すると細胞の 形状が細長い形をした扁平状に変化していることが確認できた。またF-アクチンに高い結合力を示すペプチド ファロイジンを用いて細胞染色を行った結果、 TGF-β添加によってアクチンフィラメントの形成が有意に観察された。さらに発現タンパク質の変化をウェスタンブロット法により調べた結果、上皮系マーカー のケラチン13、ケラチン15の発現量が低下し、間葉系マーカーのフィブロネクチンの発現量が増加した。これら結果は、表皮細胞であるHaCaTがTGF-β添加に よって間葉系細胞の特性を獲得しつつあることを意味する。 一方、口腔癌細胞としてSAS細胞、HSC-4細胞、HSC-3細胞を準備し、EMTの誘導が起こるか調べた。HaCaTと同様にTGF-β添加-48時間後に細胞を観察したとこ ろ、SAS細胞とHSC-4細胞のみに細胞質が大きく肥大する変化が見られた。両細胞はファロイジン染色においてもアクチンフィラメントの形成が観察された。発現タンパク質の変化も同様にウェスタンブロット法により調べた。SAS細胞はフィブロネクチンの発現量の増加が確認されたが、上皮系マーカーは検出できなかっ た。HSC-4細胞はHaCaTと同様に上皮系マーカーが減少し、間葉系マーカーが増加した。HSC-3細胞は上皮系マーカーのケラチン15のみ減少が確認できた。 他のマーカータンパク質などを用いて正常細胞/癌細胞間におけるEMT誘導の違いの解析に適した細胞を判断したい。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
各細胞にTGF-β添加を行い、EMTを誘導した。誘導前後の細胞変化、上皮系マーカー及び間葉系マーカーとなる発現タンパク質の変化を比較することで正常細胞 HaCaT細胞(HaCaT)との比較に用いる癌細胞を絞った。その結果、誘導前後で大きく変化が見られたHSC-4細胞(HSC-4)とSAS細胞(SAS)を用いてHaCaTと比較を行うことにした。
エピゲノム解析としてChIP-Seqを行う予定であるがその前解析としてクロマチン構造の制御に関与しているヒストンの修飾状態をウエスタンブロット法にて比較した。EMT誘導前後の細胞から得た細胞抽出液をヒストン修飾を特異的に検出できる抗体(ヒストン H3の4番目、27番目のリジンーH3K4, H3K27ーのアセチル化/メチル化修飾など)を用いた。その結果、いくつかの問題が発生し、進捗に遅延が出た。
問題の１つが正常細胞 HaCaTにおけるEMT誘導前後のヒストン修飾の変化が想定より見えなかったことである。これはヒストン修飾に関わる阻害剤を使いコントロールを設定すること、ヒストン脱アセチル化(HDAC)阻害剤 酪酸ナトリウムを添加して細胞抽出液を回収することで大きな改善が見られた。2つ目の問題はSASから回収した細胞抽出液に含まれるヒストン量が想定よりも少なかったことである。次の解析で予定しているChIP-Seqはデータクオリティの確保にある程度のヒストン量が必要である。手技による改善を試みたが大きな変化が見られなかったため、途中まで比較していたHSC－３細胞を今後の解析に用いることにした。
上記の問題によりやや遅れているが、全体を通して進展できている。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在、追加データとしてHSC-3のヒストン修飾を解析している。この解析が終わり次第予定していたChIP-Seqを行うためのChIP法の条件検討を行う。共沈させる抗体にはヒストン H3、もしくはヒストン H3のリジン27のアセチル化(K27Ac)の抗体などで検討を行う予定である。そのためいくつかの抗体を購入し、検討を行う。
当初、ChIP-Seq解析はシークエンシングから結果の解析まで外部の研究機関に依頼して外注する予定であったが解析依頼が想定よりも高額であることなどの問題が判明したため次世代シークエンサー(NGS)によるシークエンスのみを外部に依頼し、NGSから取得したデータの解析を自分ですることに変更する。そのためデータ解析系の立ち上げが新たに必要となった。
ChIP法の条件検討とデータ解析系の立ち上げは同時並行で進めることで時間のロスを最小限にしたい。
本年度中にウエスタンブロット法にてヒストン修飾を比較したデータなどをまとめ、学会等に参加し研究成果を発表したい。
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| Causes of Carryover |
ウェスタンブロット法によるヒストン修飾の解析の問題によって研究の進捗にやや遅れが生じた。その遅れによりChIP-Seqの外部委託を行わなかったため。外部委託をすると想定よりも高額、かつ納期が長期化することがわかった。そのため比較的早く結果がでる次世代シークエンサーのシークエンスのみを委託し、データの解析を自分で行うことにした。次年度で次世代シークエンサーの外部委託、並びにそのデータ解析系の立ち上げに使用する予定である。
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