2020 Fiscal Year Research-status Report
細胞外マトリックス制御による悪性末梢神経鞘腫瘍に対する新規治療
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19K16769
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
生田 国大 名古屋大学, 医学部附属病院, 病院助教 (40732657)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 肉腫 / 細胞外マトリックス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
悪性末梢神経鞘腫瘍（MPNST）は化学療法や通常の放射線の治療効果が不十分であり、その標準治療は手術治療のみである。研究開始して2年経過した現在でも、MPNSTに対して見込みのある新規薬剤の情報はない。本研究の目的は、悪性末梢神経鞘腫瘍（MPNST）においてヒアルロン酸合成阻害剤である4-methylumbelliferone（4-MU）による既存抗がん薬の抗腫瘍効果の増強作用を評価することで、実現可能な治療戦略を開発することである。研究実績として、令和1年度は主にin vitro実験を中心に進めた。ヒトMPNST細胞株（sNF96.2、sNF02.2）を用いて、4-MU 投与下における腫瘍細胞周囲および細胞内ヒアルロン酸の評価について、particle exclusion assay にて細胞周囲マトリクスの可視化、ELISA にて細胞内／細胞周囲／培養液中のヒアルロン酸濃度測定をおこなった。ヒアルロン酸合成酵素（HAS1-3）とヒアルロン酸受容体CD44 発現についてペルオキシダーゼ標識した抗体による細胞免疫染色とmRNA 解析にて評価した。さらに、HAS1-3 とCD44 のsiRNA によるknockdown 条件下において、腫瘍原性がどう変化するか観察するためにMTS assay、invasion assay、migration assay により評価した。また、臨床検体でのvalidityを評価するために、MPNST患者の腫瘍組織を採取して培養、継代をおこない細胞株を樹立した。令和2年度は、樹立した細胞株について同様に、上記アッセイ、解析をおこなった。ヒトMPNST細胞株による皮下移植マウスモデルの作製と生存解析、および移植腫瘍を用いたex vivo実験を令和2年度の課題としたが進捗は遅延している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
4-MUの抗腫瘍効果について、ヒトMPNST細胞株を用いた皮下移植マウスモデル作製（in vivo）は予定通り完了している。In vitroにおいて抗がん薬の選定が済んでいないため、当面はヒトMPNST細胞株における各種抗がん薬のアッセイが優先される。遅れている理由として、MTTアッセイやアポトーシス活性をはじめとするin vitro実験では、ヒトMPNST細胞に対するダメージが臨床血中濃度を用いた場合に強く出てしまい、各種抗がん薬間の有意差を抽出できなかった。まずは細胞株に対する抗がん薬の至適濃度を同定することが急がれる。今般のCOVID19のパンデミックにより、研究計画は大きく影響を受けている。年度初めには本学ガイドラインにてCOVID19に関連する研究以外の研究活動の休止が指示され、動物実験施設への出入りも規制された。ピペットなど消耗品やPCR試薬の欠品や納入遅延も問題となった。現在は感染防止措置の上、実施可能と活動指針が緩和されたが通常とおりではない。また研究代表者は、診療従事者として、ＣＯＶＩＤ対策に伴う臨床業務負担の増加に対応している。現在はＩＣＵ部門でのCOVID診療応援をおこなっており、他部門との接触を回避しているため本研究には従事できていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度においては、早急な研究再開と進展について努力する。
有望な候補薬を抽出後に、薬剤輸送体に対する4-MU の作用の解析をin vitroでおこなう。MPNST 細胞株において、膜蛋白に存在する薬剤輸送体MDR1、MRP1、BCRPのmRNA と蛋白発現を評価する。各輸送体の抗体を用いて細胞免疫染色をおこない、抗がん薬および4-MU 投与による発現変化について評価する。抗がん薬および4-MU 投与による各輸送体のmRNAと蛋白量の変化について、リアルタイムPCR、ウェスタンブロッティングにより解析する。MPNST異種移植マウスモデルにおける腫瘍原性の評価 (in vivo)について、抗がん薬と4-MU 併用群、4-MU 投与群、抗がん薬投与群、コントロール群（vehicle）を作製し、各群における抗腫瘍効果、遠隔転移抑制、生存率曲線による生命予後を解析する。抗腫瘍効果については腫瘍重量および肺転移数の解析により局所および遠隔転移に対する効果を評価する。Ex vivo実験として、各群の異種移植腫瘍におけるヒアルロン酸、ヒアルロン酸合成酵素（HAS1-3）、薬剤輸送体蛋白発現を組織染色およびELISA（ヒアルロン酸）、mRNA（HAS1-3、薬剤輸送体蛋白）、ウェスタンブロッティング（薬剤輸送体蛋白）を評価、比較する。研究環境として、技官および研究助手の勤務制限、テレワーク解除を期待する。
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| Causes of Carryover |
１．実験計画で予定していた抗がん剤と4-MUによる抗腫瘍効果の相乗効果の測定と評価について本年度は未施行であるため。
２．In vitro実験の遅れに伴い、候補薬を用いたMPNSTマウスモデルによる評価の進捗に遅れをきたしたため。
使用計画:皮下腫瘍マウスモデル作製のためのマウス購入費、飼育費および組織染色と各種アッセイに必要な抗体や試薬の購入のために研究費を使用する。今後、研究結果の発表に関連する学会および論文校正費用、また研究に関連する書籍の購入費用に研究費を使用する。
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[Journal Article] Forced expression of KIAA1199, a novel hyaluronidase, inhibits tumorigenicity of low-grade chondrosarcoma2020
Author(s)
Koike Hiroshi, Nishida Yoshihiro, Shinomura Tamayuki, Zhuo Lisheng, Hamada Shunsuke, Ikuta Kunihiro, Ito Kan, Kimata Koji, Ushida Takahiro, Ishiguro Naoki
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Journal Title
JOURNAL OF ORTHOPAEDIC RESEARCH
Volume: 38
Pages: 1942-1951
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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