大腸癌における転写因子KLF5蛋白複合体の機能解明と創薬応用

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K16777
• Research Institution: Jichi Medical University
• Principal Investigator: 辻 賢太郎 自治医科大学, 医学部, 臨床助教 (00835712)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 大腸癌 / KLF5

Outline of Annual Research Achievements

切除不能な進行大腸癌の予後は不良であり、高い有効性と安全性を持つ新規薬剤の開発が望まれる。KLFファミリーは個体発生や心血管疾患、癌などの多彩な病態に関与する転写因子群である。その一つであるKLF5は腸上皮の陰窩底部優位に発現しており、正常腸上皮幹細胞の維持・増殖に加え、Wntシグナル系のメディエーターとして腸上皮幹細胞からの腫瘍形成にも重要な役割を持つ。変異活性型β-Catenin誘導による大腸癌モデルマウスの腸上皮幹細胞でKLF5をノックアウトすると腫瘍形成が抑制されることも既に見出されており、KLF5は進行大腸癌の新たな治療標的として期待される。
我々はこれまでの研究でKLF5の蛋白間相互作用を阻害すると予想される低分子化合物の創薬を試み、この化合物が正常細胞を傷害することなく大腸癌細胞の増殖を抑制することを見出した。さらにヒト大腸癌細胞株を移植したXenograftモデルにおいて明らかな有害事象なく癌の増殖抑制効果を示すことも確認している。しかし、本化合物の癌選択的な増殖抑制効果の詳細な分子作用機構は明らかでない。本化合物はKLF5蛋白複合体を修飾するものと予想されるが、生理的状態と病的状態それぞれにおけるKLF5の蛋白間相互作用あるいは蛋白核酸相互作用の全体像は十分に解明されていない。
本研究では、FLAG-HAダブルタグ融合KLF5蛋白を恒常的に発現する遺伝子改変マウスを用いて、正常腸組織と腫瘍組織それぞれにおけるKLF5蛋白複合体解析を行う。初年度は正常腸組織由来蛋白抽出液の免疫沈降産物に対して質量分析を行い、KLF5結合蛋白の網羅的解析を行った。並行して、CreERT2-loxPシステムにより腸上皮選択的に変異活性型β-Cateninを誘導する腫瘍形成マウスの作出を進めた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

初年度はFLAG-HAノックインマウス由来組織に対する抗FLAG抗体・抗HA抗体を用いた2回免疫沈降法によるKLF5蛋白複合体精製の実験系を確立し、正常腸組織におけるKLF5蛋白複合体の質量分析データを得ることができた。これらの候補蛋白の中から、KLF5との相互作用が既知でなく機能に興味の持たれる複数の蛋白についてはウェスタンブロットによる検証を行い、一部の蛋白については実際にKLF5との相互作用を示唆する結果を得た。さらに、KLF5蛋白複合体のDNA結合領域同定のため、正常腸組織からのクロマチン免疫沈降の条件検討を現在進めている。またこれらの正常腸組織を用いた実験と並行して、腫瘍組織を用いた蛋白複合体解析に供するため、変異活性型β-Catenin誘導による腫瘍形成マウスの作出ならびにこのマウスとFLAG-HAノックインマウスとの交配を進めている。当初の計画では正常腸組織を用いたクロマチン免疫沈降シークエンスまで初年度中に行う予定であったが、クロマチン免疫沈降の条件検討に難航し遅延を生じた。

Strategy for Future Research Activity

正常腸組織のクロマチン免疫沈降シークエンスとデータ解析を行い、KLF5蛋白複合体のDNA結合領域を同定する。さらに腫瘍組織を用いて同様の質量分析とクロマチン免疫沈降シークエンスを行い、正常組織と腫瘍組織との間でKLF5蛋白複合体の構成分子や転写調節領域がどのように変動するかを解析する。これらの解析を踏まえて大腸癌の発癌や増殖に関わる新規の分子経路を探索する。

Causes of Carryover

当初支出予定していた物品費やその他の経費はいずれも講座研究費等で賄うことができたため、当該年度使用経費に余剰が生じた。