2019 Fiscal Year Research-status Report

Research for the way to enhance the infiltration of tumor antigen specific CTLs into tumors

Research Project

Project/Area Number	19K16863
Research Institution	Osaka University
Principal Investigator	中田潤大阪大学, 医学系研究科, 助教 (90528952)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	癌免疫 / WT1 / 癌ワクチン療法
Outline of Annual Research Achievements	既に樹立したWT1ワクチン療法皮下腫瘍モデルにおいて腫瘍内に浸潤する免疫細胞よりWT1-35ペプチド特異的CD4T細胞（以下、WT1-CD4）、WT1-126ペプチド特異的CD8T細胞（以下、WT1-CTL）を取り出し、in vitroにてsingle cellから増幅することに成功した。このsingle cell由来の増殖したWT1-CD4、WT1-CTLにおいてサイトカインアッセイにてその特異性を確認した上でmRNA抽出～cDNA作成を行い、RACE PCR法にてそのV/D/J領域を増幅している。WT1-CTLに関しては既に2クローンを同定しα鎖、β鎖をつないだレトロウイルスベクターを作成した。今後、Retrogenic mouseシステムにおいて各種クローンの質的な比較を行い、最も抗原特異的免疫反応が強いクローンを用いてTCR transgenic mouseを作成予定である。WT1-CD4に関しては適切なテトラマ抗体がなく、メモリー分画全体をsingle cell sortして増やすとWT1特異的ではないCD4T細胞が増えてしまいMethod上での工夫を要した。最終的にWT1-35ペプチドを用いたIFNγキャプチャー抗体法によりWT1-CD4の増殖に成功した。今後これらのWT1-CD4T細胞よりWT1-CTL同様にmRNA抽出～cDNA作成、RACE PCR法を行っていく予定としている。また、遊走を可視化できるマウスモデルとしてKikGRマウスを購入し、CD45.1マウスと掛け合わせCD45.1+/+ KikGR+マウスを樹立した。今後このCD45.1+/+ KikGR+マウスの卵胞にWT1 TCRベクターを導入することを予定している。本研究は内在性抗原である癌抗原を標的としたCD4、CD8 TCR transgenic mouseが揃っている初めてのマウスモデルとなり、将来の腫瘍免疫の研究に有用であると考えられる。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason WT1-CTLクローンに関してはおおむね予定通りに取り出すことに成功している。既に1G3, 1H10と2つのクローンに関してレトロウイルスベクターの作成まで至った。1G3に関しては立体構造の架橋を形成しやすいためPCR増幅が困難であり、プライマー設計を繰り返す必要があった。一方WT1-CD4に関しては腫瘍中のCD44+CD62+のメモリー分画からのsortingだけだと、非特異的CD4T細胞が多く増殖し、WT1-CD4の単離が困難であった。sortingの分画を様々変えるも改善せず、最終的にWT1-35ペプチドにてペプチドパルスしたFeeder細胞とco-cultureした後、IFNγキャプチャー抗体強陽性分画を選択的にsortingすることにより、一定の頻度でWT1-35ペプチド特異的なCD4T細胞を単離・増殖することに成功した。本条件を見出すのに時間を要したが、その後の系はCD8T細胞において確立されており、計画全体としてはおおむね順調に進展していると考える。
Strategy for Future Research Activity	WT1-CTLクローンに関しては既に2クローンを作成したが、3クローンまでを作成した上でその癌免疫機能として、WT1-126ペプチド特異的なサイトカインアッセイ、Cr relasingアッセイなどのin vitroでの細胞障害性の評価、さらにはCD45.1 congenic mouseを用いた皮下腫瘍モデルにおいて皮下腫瘍内に最も遊走、増殖するクローンの確認などを行い、腫瘍免疫において最も良いクローンを同定する。WT1-CD4クローンはCTLクローン同様にベクター作成を行っていく。これらのクローンをCTLクローンはKikGRマウスで、CD4をAPC系の色素マーカーで検出できるようTransgenic mouseを作成する。 TCR transgenic mouseを用いて、腫瘍内に遊走されるCD4/CD8T細胞の特質を探索する。また、腫瘍内への腫瘍免疫の郵送や腫瘍内増殖を制御する細胞集団の同定を目指す。