痛みに応答する一次体性感覚野神経細胞の不安障害及び睡眠障害への影響

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K16909
• Research Institution: Kanazawa University
• Principal Investigator: 石川 達也 金沢大学, 医学系, 助教 (00750209)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 疼痛 / 不安様行動 / 大脳皮質一次体性感覚野 / DREADD

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、痛覚認知に重要な役割を果たすと考えられている大脳皮質一次体性感覚野(S1)が不安様行動や睡眠障害に関与するか検討することを目的とした。
令和元年度の研究計画では、痛みに応答したS1の神経細胞にのみの神経活動を興奮または抑制させた際、1)後肢の機械刺激に対する閾値の低下が誘発されるか、2)これに伴い不安様行動も生じるか行動学的に検討した。
そのために、複数のアデノ随伴ウイルス(AAV: cfos-Cre, hSyn-DIO-hM3Dq-mCherryまたはhSyn-DIO-hM4Di-mCherry)をS1に接種し、痛みに応答したS1の神経細胞にのみ化学遺伝学的手法(DREADDシステム)が構築されたマウスを作製した。このマウスに人工リガンドであるクロザピンNオキシド(CNO)を投与し痛みに応答した神経細胞のみの神経活動を興奮または抑制させた際、神経活動依存的に後肢の機械刺激に対する閾値の変化を誘導することができた(S1の興奮：後肢の閾値低下、S1の抑制：痛発物質により痛みが生じている後肢の閾値低下を減弱)。さらに、CNOにより痛みに応答したS1の神経細胞の活動を興奮または抑制すると、神経活動依存的に不安様行動も誘導されることを行動学的に明らかにした(S1の興奮：不安様行動の誘発、S1の抑制：痛発物質投与による不安様行動の抑制)。以上の結果から、少なくともS1は痛覚認知だけでなく不安様行動にも関与していることが示唆された。
また、痛みに応答したS1の神経細胞は前帯状回（背側部）、二次運動野、線条体、視床、視床下部等への軸索投射が存在することが免疫組織化学的手法により認められた。これら脳領域とS1の神経回路が不安様行動を引き起こしている可能性が示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

令和元年度は、痛み刺激に応答したS1の神経細胞にDREADDシステムが構築されたマウスの作製に成功した。このマウスを用いて以下1-3の研究結果を得ることができ、少なくともS1が痛覚認知のみならず不安様行動に関与することを見出した。したがって、おおむね研究計画通りに研究が進捗しており本研究課題は順調に進展していると考えられる。

1.痛みに応答したS1の神経細胞のみを人為的に抑制した場合、痛発物質投与により惹起される後肢の(機械刺激に対する)閾値の低下が減弱された。さらに、痛発物質投与により惹起された不安様行動もS1の人為的な抑制により減弱した。
2.痛みに応答したS1の神経細胞のみを人為的に興奮させると後肢の機械刺激に対する閾値の低下や不安様行動が誘発された。
3.痛みに応答したS1の神経細胞が、前帯状回(背側部)、二次運動野、線条体、視床、視床下部等へ軸索投射していることを見出した。

Strategy for Future Research Activity

今後の研究の推進方法に関して以下1)-4)の実験を実施し、S1の痛みに応答する神経細胞が痛みのみならず不安様行動や睡眠障害等に関与するか行動薬理学的手法を用いて検討してく予定である。さらにS1とどの脳領域の神経回路が、S1を介した不安様行動や睡眠障害を司っているか詳細に検討する。
1) DREADDシステムが構築されたS1の神経細胞はCNO依存的にその神経活動を誘導することが可能かin vivo 2光子カルシウムイメージング法で検討する。
2) S1からの投射が認められた前帯状回(背側部)、二次運動野、線条体、視床、視床下部等でシナプスが形成されているか免疫電子顕微鏡法もしくは免疫組織化学法で検討する。
3) ２）の研究で痛みに応答するS1の神経細胞とのシナプスが確認された脳領域のうち、CNO投与によるS1の活性化と同期してどの脳領域(の神経細胞)が活性化するか最初期遺伝子c-Fosの発現を免疫組織化学的手法により計測し検討する。
4) ３）の実験結果からS1の活性化と同期して活動が亢進する脳領域に対して拮抗薬や阻害薬(CNQX, AP-5, Gabapentin, TTX等)を投与しS1とどの脳領域間の神経回路が(S1を介した)痛みに伴う不安様行動を司っているか、行動薬理学的に検討する。

Causes of Carryover

共通実験施設に既に手術用実態顕微鏡やマイクロシリンジポンプの代用が可能な微量注入ポンプ等が備わっており購入を見合わせることができたため、費用を軽減することができた。したがって、以下1)-2)に記す通り本年度計画している実験(免疫電子顕微鏡法にシナプス形成の有無や行動薬理学実験)に使用する試薬や消耗品の購入に充てる予定であるため次年度使用額とした。
1) 令和2年度に計画している免疫電子顕微鏡を用いた痛みに応答するS1の神経細胞とシナプスを形成する脳領域の解析に必要な抗体や試薬の購入に充てる予定である。
2) 行動薬理実験を実施する際に用いる試薬(CNQX, AP-5, Gabapentin, TTX等)や人工リガンド(CNO)の購入が必要であり、その費用に充てる予定である。

Research Products

• [Journal Article] Microglial SIRPα regulates the emergence of CD11c+ microglia and demyelination damage in white matter. (2019)
  • Author(s): 1.Sato-Hashimoto M, Nozu T, Toriba R, Horikoshi A, Akaike M, Kawamoto K, Hirose A, Hayashi Y, Nagai H, Shimizu W, Saiki A, Ishikawa T, Elhanbly R, Kotani T, Murata Y, Saito Y, Naruse M, Shibasaki K, Oldenborg PA, Jung S, Matozaki T, Fukazawa Y, Ohnishi H.
  • Journal Title: elife. Volume: eLife 2019;8 Pages: e42025.
  • DOI: 10.7554/elife.42025.
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research