2019 Fiscal Year Research-status Report
全身性炎症による脳内痛みネットワークの可塑的変化と痛覚過敏への関与の解明
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19K16932
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| Research Institution | Jikei University School of Medicine |
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Principal Investigator |
杉村 弥恵 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助教 (20825997)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 炎症 / 腕傍核 / 扁桃体 / 中脳水道周囲灰白質 / シナプス伝達 / 光遺伝学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
全身性炎症が痛覚過敏を引き起こす脳内機構の解明を目的とし、以下の実験を行なった。
（１）全身性炎症モデルにおける痛覚過敏と扁桃体中心核（CeA）における最初期遺伝子（Fos）発現の評価：lipopolysaccharide (LPS) 腹腔内投与によって全身性炎症を誘発した野生型マウスと、対照群として生理食塩水を投与したマウスの機械刺激性痛覚閾値を測定した結果、投与2時間後に閾値の低下を認めた。また、RNA多重in situ ハイブリダイゼーションを行なったところ、protein kinase C-δ (PKCδ) 陽性ニューロンでFos発現が認められた。
（２）全身性炎症が外側腕傍核（LPB）-CeA経路に及ぼす影響の解析：Calcitonin gene-related peptide (CGRP)プロモーター下流 にCreリコンビナーゼを発現するCalca-CreマウスのLPBに光活性化陽イオンチャネル（ChR2）発現アデノ随伴ウィルス（AAV）ベクターを脳内微量注入し、LPBのCGRP陽性ニューロン特異的にChR2を発現させた。LPS腹腔内投与から2時間後に急性脳スライス標本を作製し、CeAニューロンの発火特性と光刺激誘発シナプス応答を記録した。その結果、LPS投与群では、CeA局所回路を介した多シナプス性抑制性応答が減弱している傾向が認められた。
（３）全身性炎症がCeAから下行性疼痛制御系への出力に及ぼす影響の解析：Calca-CreマウスのLPBにChR2発現AAVベクターを、また、中脳水道周囲灰白質（PAG）に逆行性トレーサーを微量注入した。CeA内側部にPAG投射ニューロンが分布することを確認した。さらに、LPS投与2時間後に急性脳スライス標本でPAG投射ニューロンから記録し、発火特性および光刺激誘発シナプス応答に及ぼすLPSの影響の検討を進めた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は主にCalca-Creマウスを用いて全身性炎症がCeAニューロンに及ぼす影響について、電気生理学的解析を行なった。CeAは3つの亜核に分類され、また異なる発火特性をもつニューロンから構成されることから、それぞれの亜核・発火パターンごとに十分な例数を記録するのに時間を要したものの、それぞれに特徴的な変化が示唆される結果が得られつつある。一方、全身性炎症モデルマウスの機械刺激性痛覚閾値の測定、RNA多重in situ ハイブリダイゼーションによるFos発現の評価は予定通りに実施した。また、痛覚過敏に関わる細胞集団と機能的役割の同定のため、細胞死誘導による実験プロトコールの最適化に着手している。以上の状況から、おおむね順調であると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）全身性炎症がLPB-CeA経路、PAG投射ニューロンに及ぼす影響の解析：引き続き、PAG投射ニューロンからホールセルパッチクランプ記録を行ない、十分なデータ数を確保する。またPKCδ、somatostatinなどのマーカー特異的に蛍光たんぱくが発現する遺伝子組換えマウスや野生型マウスのCeAニューロンから記録することも検討している。
（２）痛覚過敏に関わる細胞集団と機能的役割の同定：逆行性取込み輸送型AAVベクターをCeAまたはPAGに導入してCreリコンビナーゼを発現させ、Cre依存的にLPBまたはCeAニューロンにジフテリア毒素A（DTA）を導入する（細胞死誘導）。またはCre依存的に抑制性DREADD人工受容体を導入する（人工的リガンド投与による細胞抑制）。これらの動物において，LPS投与による全身性炎症を誘発し、機械刺激性痛覚閾値を計測することによって、選択的ニューロン除去、および、選択的ニューロン活動抑制が及ぼす影響を評価する。PKCδ、somatostatinなどのマーカー特異的にCreが発現する遺伝子組換えマウスの使用も検討している。
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| Causes of Carryover |
予想以上に扁桃体ニューロンの電気生理学的特性に多様性が認められたため、本年度は行動実験など、その他の計画より優先的に電気生理学的解析に取り組んだ。結果として初年度に予定していたウィルスベクターの購入を次年度に延期することになった。また、PKCδおよびsomatostatinの二つのCeAにおける代表的な分子マーカーについてRNA多重in situ ハイブリダイゼーション(RNAscope)を実施したが、CeAニューロンを電気生理学的特性および亜核ごとに分類・評価した上で、既報を参考に別の分子マーカーを対象としてFos共発現を検討するため、新たなプローブの購入費用を次年度に繰り越して使用する予定である。
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