血小板由来マイクロパーティクルの基礎的性状の解明と生体内の役割に関する研究

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K16954
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 塩津 弘倫 九州大学, 医学研究院, 助教 (90625766)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: マイクロパーティクル / miRNA / 臨床検査

Outline of Annual Research Achievements

ヒト血中に存在する血小板由来マイクロパーティクル(Platelet-derived microparticle, PMP)は、血小板の活性化にて放出され、放出されたPMPが他の血小板や血管内皮などに取り込まれることによって凝固を促進する因子の一つである。このPMP内にはマイクロRNA(miRNA)が豊富に含まれているものの、PMPおよびそれに含まれるmiRNAの実際の役割は未だ不明な点が多い。
申請者は採血管内の血清、血漿でのPMP分布の違いに着目し、静脈内での血栓形成時にはPMPを介した血小板および周辺細胞への情報伝達機構が存在し、特にPMP内miRNAによる遺伝子発現制御が凝固を促進する因子となり得るとの仮説を構築した。本研究では上記仮説を検証し、PMP内miRNAが生体内で果たす役割の解明や新規バイオマーカーとしての可能性に関して検討を行っている。
本年度は培養細胞を対象とした巨核球への誘導系の確立とフローサイトメトリー(FCM)を用いた培養細胞より放出されたPMP解析系の確立を行った。また、培養系の検証と並行した細胞内およびPMP内に存在するmiRNAの解析を行った。
FCM解析では、巨核球系への分化に伴いPMP表面の膜タンパク発現プロファイルが変化すること、また細胞種によって発現する膜タンパクが異なることを確認した。また細胞内、PMP内の血小板特異的miRNAを定量解析したところ、細胞種によって、変化の度合いが変わることや、PMP内よりも細胞内でその変化が顕著であることを認めた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

1.ホルボールエステル(PMA)を用いた培養細胞の巨核球への培養系の確立と評価
複数の培養細胞を用いて、PMA濃度の変化させ検証を行ったところ、メイ・ギムザ染色による形態変化(細胞サイズおよび核の増大)が最も顕著に得られ、かつ細胞のviabilityの低下を認めない濃度を決定することができた。
また、CD41・CD61を用いたFCM解析において細胞の表面マーカーが共にdouble positiveを示したことなどから、巨核球系への分化を確認することができたため、適切な条件設定ができているものと考えられる。細胞およびPMPを対象としたmiRNA解析においても、血小板特異的miRNAの増加を認めたことも、巨核球系分化の証左の一つであると考えられる。
2.In vivo, In vitroでの解析結果の比較
今回1.にて使用したCD61、CD41は血小板表面に発現しており、血小板の活性化に際して展開し共に検出可能となる。申請者の先行研究では、PMP表面マーカーは血小板の活性化状態に関わらずdouble positiveであるといった結果も得られている。今回構築した培養系やFCM評価系を用いることで、In vivo, In vitroから得られたPMPを比較し、新しい知見を得る可能性も考えられた。

Strategy for Future Research Activity

構築した誘導系を用い、細胞内およびPMP内miRNAの網羅解析と詳細な定量解析を実施予定である。
また、誘導前後で得られたPMPを用いたPMPの機能解析を予定している。
さらに健常者ボランティアを用いた、ヒト血中に存在するPMPを対象としたIn vivoでの解析も検討中である。

Causes of Carryover

当該年度は既存の試薬や細胞株を使用しての実験が主であったこと、次年度以降に予定しているmiRNAの網羅解析が高価であり、今年度以降の使用が適切であると考えられたため。