2020 Fiscal Year Research-status Report
「血小板内シグナル伝達と巨核球分化」2つに機能するPBX2分子の新規機構の解明
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19K16984
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
小浜 祐行 鹿児島大学, 鹿児島大学病院, 臨床検査技師 (50837276)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 血小板 / 血小板機能異常症 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
診断に至らない原因不明の出血傾向を呈する血小板機能異常症の症例において、同一家系内におけるエクソーム解析を行った結果、責任遺伝子としてPBX2を発見した。
血小板凝集能検査結果から、①血小板内シグナル経路において、PBX2を介した新規の経路が存在する、②PBX2が巨核球分化へ関与している、2つの仮説を立てた。これら2つの仮説を解明することを研究目的とし、仮説①の解明に向けて検証を行った。まず、対照および患者の血漿から洗浄血小板を作成し、ADP,EPI,TRAP刺激後の血小板活性化表面マーカーであるCD62P, PAC-Iの発現量をそれぞれフローサイトメトリーにて検証した。検証の結果、対照と患者において、ADP刺激後のP2Y12受容体を介する経路におけるCD62P,PAC-Iの発現量には、差が生じなかった。
しかし、EPI刺激後のα2A受容体を介する経路におけるPAC-Iの発現量は、患者が対照と比較して3分の1低下していた。また、TRAP刺激後のCD62P,PAC-Iの発現量は、患者が対照と比較して、それぞれ3分の1低下していた。よって、仮説で示しているアデニル酸シクラーゼサイクル(AC)活性化後の下流領域もしくは上流領域にPBX2が関与している可能性がより高まったと言える。
また、仮説②解明における準備段階として、PBX2変異体の作成を行った。PBX2変異遺伝子が搭載したプラスミドベクターおよび、PBX2野生型遺伝子が搭載されたプラスミドベクターの作成が完了し、それぞれのシーケンス配列確認とDNAの大量調整までが完了している。
今後、Meg01細胞へそれぞれをトランスフェクションし、mRNAの網羅的解析を行う予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
新型コロナウイルス感染の蔓延により、検査技師としての業務が増大し、研究に影響が生じた。
まず、当初予定していた仮説②解明におけるPBX2変異体の作成に遅れが生じた。現在、業務と研究が両立でできるよう工夫しながら行っている。よって、現在PBX2変異体の作成が完了した段階である。今後作成したPBX2変異体を細胞へトランスフェクションしmRNAの網羅的解析を早急に行っていく予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
今回の検証結果から、仮説①血小板内シグナル経路において、PBX2を介した新規の経路が存在するにおいて、仮説で示しているアデニル酸シクラーゼサイクル(AC)活性化後の下流領域もしくは上流領域にPBX2が関与している可能性がより高まった。
データベースにおいて、PBX2プロモーターの上位の転写因子結合部位遺伝子としてCyclic AMP-responsive element-binding protein (CREB)が報告されている。CREBは血小板でも発現が認められており、発生段階でephA8の調節配列に関与することが報告されている。今回の検証から、PBX2が血小板内におけるCREBと関与しているかもしれない可能性がより高まった。仮説②におけるmRNAの網羅的解析においても同様に検証を行う予定である。
仮説②PBX2が巨核球分化へ関与しているにおいては、巨核球系培養細胞Meg01にthrombopoietin (TPO) を加え、血小板の形態変化や分泌顆粒形成を観察する。更に、Meg01細胞においてPBX2をsiRNAによりノックダウンし、分化能変化を検証する予定である。
また、作製した野生型および変異型PBX2プラスミドベクターをMeg01細胞へトランスフェクションし、野生型PBX2と変異型PBX2の両者の発現量を確認する。そして、野生型PBX2および変異型PBX2導入後のMeg01細胞からそれぞれタンパク質およびmRNAの抽出を行う。最後に、PBX2の発現を確認後、マイクロアレイを用いて、mRNAの網羅的解析を行う。以上を計画的に進行していく予定である。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルスの蔓延により、検査技師としての業務が増大し、約半年間の研究が不能であった為、次年度使用額が生じた。次年度使用額は、当初から計画している実験に使用する試薬等の物品費として、計画的に使用する予定である。
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