筋強直性ジストロフィーの骨格筋障害機構解明

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K17007
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 蓮池 裕平 大阪大学, 医学部附属病院, 医員 (90838351)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 筋強直性ジストロフィー / 骨格筋障害

Outline of Annual Research Achievements

筋強直性ジストロフィー（DM）は、CTGやCCTGといった塩基繰り返し配列（リピート）の異常伸長が原因の遺伝性筋疾患である。DMでは変異遺伝子より転写された、異常伸長リピートをもつRNAの毒性により、スプライシング制御機構の障害を来すが、DMでみられる最も重要な症状である進行性筋萎縮の詳細な機構はいまだ解明されていない。DM患者由来筋芽細胞で筋分化障害や早期分化停止が報告されているものの、筋採取時の患者年齢や筋芽細胞誘導時の条件の違いなどのため患者由来細胞での解析には限界がある。
こうした筋分化障害や早期増殖障害の機序を明らかにするため、前年度までに様々な異常伸長リピートを持つCTG繰り返し配列を合成し、C2C12マウス筋芽細胞やTIG-3初代線維芽細胞に導入し最適なモデル細胞を構築した。本年度は、これらのモデル細胞を使用しsenescence-associated beta galactosidase (SA-beta-gal)陽性細胞などの老化細胞で特にDNA損傷マーカーが増加することを明らかにした。また、リアルタイムPCR法にてテロメア長を測定し、異常伸長リピート発現とテロメア長短縮が関連しないことを明らかにした。現在、RNAseqによる解析にて、有意に発現変動し細胞老化と関連する遺伝子群を同定している。
本年度の研究実績にて、様々なリピート長を持つDM細胞モデルを使用し、DMにおける細胞増殖の早期停止がテロメア短縮と直接関連しないpremature senescenceによることを明らかにした。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

今までにDMにおける筋分化障害、老化現象を解析する最適な細胞モデルはなく、pDWDプラスミドコンストラクトを用いて、ADER法により異常伸長リピートを持つCTG繰り返し配列を合成した。これをpLLC16プラスミドコンストラクト内のDMPK３’UTR配列に挿入し、C2C12マウス筋芽細胞に導入して様々な超伸長リピートを持つstable cloneを確立した。TIG-3初代線維芽細胞へ導入し、細胞老化を引き起こしDNA損傷が増加することを確認した。また、リピート発現の有無はテロメア短縮に影響しないことを確認した。モデル細胞を用いたRNAseq解析により、細胞老化と関連する遺伝子群を同定しており、現在追加解析を進めている。

Strategy for Future Research Activity

今後は、今回明らかになったDMモデル細胞における細胞老化現象、DNA損傷について、さらに詳細な分子機構を検証する。
TIG-3初代線維芽細胞を用いたRNA-seq解析を施行し、細胞老化現象などに関連する遺伝子発現変動を複数同定しており、これらの遺伝子機能評価を行う。

Causes of Carryover

今年度の研究については、研究室の既存の設備ならびに資材を使用して研究を行った。次年度以降の分子生物学関連試薬の消耗品購入費用に充当する。