2019 Fiscal Year Research-status Report
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19K17044
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| Research Institution | Nara Medical University |
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Principal Investigator |
井口 直彦 奈良県立医科大学, 医学部附属病院, 研究員 (50838232)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | Danon病 / オートファジー / 脳オルガノイド / オルガノイド / CRISPR/Cas9 / ダノン病 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
LAMP-2変異型ヒトiPS細胞を用いたヒト脳オルガノイドを作成の前に、野生型ヒトiPS細胞を用いたヒト脳オルガノイドの作成、評価を行い、LAMP-2遺伝子発現が得られているかどうか確認を行った。作成したヒト脳オルガノイドは皮質構造を有し、免疫染色では神経細胞や成熟神経細胞の発現を確認した。大脳皮質モデルとしてのヒト脳オルガノイド作製の実験系が確立されていることを確認し、作成開始1か月時点でのヒト脳オルガノイドでは、リアルタイムPCRでヒトiPS細胞に比して有意にLAMP-2遺伝子発現が得られていることが確認された。今回「自己貪食空胞性ミオパチー」の一つであるDanon病の病態解明を目的とし、ヒトiPS細胞から樹立されたヒト脳オルガノイドや、CRISPR/Cas9によるゲノム編集などを行う計画としている。CRISPR/Cas9によるゲノム編集によりLAMP-2遺伝子の機能喪失型変異を有するヒトiPS細胞を作成し、その手法で得られたLAMP-2変異型ヒトiPS細胞を用いて脳オルガノイドを作成し、フェノタイプを解析するため、野生型ヒトiPS細胞でのLAMP-2遺伝子発現が確認されたことは重要である。
CRISPR/Cas9によるゲノム編集においては、標的とするLAMP-2遺伝子のOligoを含むCas9プラスミドを作成し、U2OS、HEC293Tなどの細胞を用い、トランスフェクションの確認を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
脳オルガノイドは樹立し解析を行っているが、LAMP-2変異型ヒトiPS細胞の樹立が成功していない。
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| Strategy for Future Research Activity |
CRISPR/Cas9によるゲノム編集を用いた、LAMP-2変異型ヒトiPS細胞の樹立を目指す。
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| Causes of Carryover |
CRISPR/Cas9によるゲノム編集を用いた、LAMP-2変異型ヒトiPS細胞の樹立が成功しておらず、脳オルガノイド作製に必要な試薬の購入が減少したため。今後、脳オルガノイド作製に必要な試薬の購入、免疫染色やリアルタイムPCRに必要な物品の購入に使用する予定である。
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