NLRP3、NLRC4疾患関連変異によるカスパーゼ1非依存性細胞死の機序解明

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K17293
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 井澤 和司 京都大学, 医学研究科, 助教 (90634931)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 自己炎症性疾患 / インフラマソーム / NLRC4 / NLRP3

Outline of Annual Research Achievements

自己炎症性疾患は、1999年Kastnerらにより提唱された自然免疫系の遺伝子異常により発症する主に遺伝性の炎症性疾患である。インフラマソームの活性化により発症する代表的な自己炎症性疾患としてNLRP3機能獲得型変異により発症するクリオピリン関連周期熱症候群と、NLRC4機能獲得型変異により発症するNLRC4異常症が存在する。クリオピリン関連周期熱症候群は周期熱、蕁麻疹様発疹、関節炎などを特徴とし、日本では100人ほどの患者がいると推定されている。病態の中心は過剰産生されるIL-1βである。NLRC4異常症は、血球貪食症候群、腸炎、蕁麻疹様発疹などを主症状とする。日本においては数十人の患者がいると推定されている。病態の中心は過剰産生されるIL-18である。
NLRP3、NLRC4の活性化による細胞死はパイロトーシスが広くしられているが、パイロトーシスとは異なるNLRP3、NLRC4インフラマソーム活性化による細胞死が存在すること、またインフラマソームは共にIL-1β、IL-18を産生するが、NLRP3、NLRC4の機能獲得型変異により、なぜそれぞれ過剰産生されるサイトカインが異なのかを明らかにすることを目的とする。
インフラマソームは痛風、心筋梗塞、多発性硬化症など種々の病気と関連しており、NLRP3、NLRP4疾患関連変異によるカスパーゼ1非依存性細胞死の機序を解明することは、インフラマソーム関連疾患の病態解明、治療標的の発見につながることが期待される。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

自己炎症性疾患は自然免疫系の遺伝子異常により発症する炎症性疾患である。クリオピリン関連周期熱症候群、NLRC4異常症はそれぞれNLRP3遺伝子、NLRC4遺伝子の機能獲得型変異によるインフラマソームの過剰活性化を主病態とする。我々はこれまでNLRP3機能獲得型変異によるインフラマソームはカスパーゼ1非依存性であることを報告している。また、単球系細胞株であるTHP-1細胞を用いて、NLRP3機能獲得型変異の疾患関連性の評価系を確立させてきた。
今年度までの研究により、NLRC4機能獲得型変異において疾患関連性を評価する系を確立することができた。これまで報告されている変異NLRC4遺伝子（T177A、T337S、V341A、H443P）をTHP-1細胞遺伝子導入したところ、野生型NLRC4遺伝子または遺伝子多型と考えられる塩基置換（L70F、S522P）の導入に比べて有意に細胞死を起こすことが再現性をもって確認された。またこの機能獲得型NLRC4変異による細胞死は、阻害薬実験により、カスパーゼ1非依存的で、カテプシンB依存的であることが確認された。また上清中のサイトカイン測定により、炎症性サイトカインが上昇していることが確認された。

Strategy for Future Research Activity

クリオピリン関連周期熱症候群、NLRC4異常症はそれぞれNLRP3遺伝子、NLRC4遺伝子の機能獲得型変異によるインフラマソームの過剰活性化が真にカスパーゼ1非依存的であるかを確認するために、カスパーゼ1をノックアウトしたTHP-1細胞を樹立する。これにより真にカスパーゼ1非依存的であるのかを確認する。その後にCRISPR/Cas9システムを用いて、THP-1細胞においてゲノムワイドノックアウトを行い、NLRP3、NLRC4に関連した細胞死の経路において必須な分子の同定を目指す。

Causes of Carryover

ゲノムワイドノックアウトの解析を次年度に行うこととしたため

Research Products

• [Journal Article] 1.Shimizu M, Matsubayashi T, Ohnishi H, Nakama M, Izawa K, Honda Y, Nishikomori R. Haploinsufficiency of A20 with a novel mutation of deletion of exons 2-3 of TNFAIP3. (2020)
  • Author(s): 1.Shimizu M, Matsubayashi T, Ohnishi H, Nakama M, Izawa K, Honda Y, Nishikomori R.
  • Journal Title: Mod Rheumatol Volume: Feb 3 Pages: 1-5
  • DOI: 10.1080/14397595.2020.1719595.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Functional evaluation of the pathological significance of MEFV variants using induced pluripotent stem cell-derived macrophages. (2019)
  • Author(s): 2.Shiba T, Tanaka T, Ida H, Watanabe M, Nakaseko H, Osawa M, Shibata H, Izawa K, Yasumi T, Kawasaki Y, Saito MK, Takita J, Heike T, Nishikomori R.
  • Journal Title: J Allergy Clin Immunol. Volume: Nov;144(5) Pages: 1438-1441.
  • DOI: 10.1016/j.jaci.2019.07.039.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Concomitant PIK3CD and TNFRSF9 deficiencies cause chronic active Epstein-Barr virus infection of T cells. (2019)
  • Author(s): 3.Rodriguez R, Fournier B, Cordeiro DJ, Winter S, Izawa K, Martin E, Boutboul D, Lenoir C, Fraitag S, Kracker S, Watts TH, Picard C, Bruneau J, Callebaut I, Fischer A, Neven B, Latour S.
  • Journal Title: J Exp Med. Volume: Dec 2;216(12) Pages: :2800-2818
  • DOI: 10.1084/jem.20190678.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Plasma infliximab monitoring contributes to optimize Takayasu arteritis treatment: a case report. (2019)
  • Author(s): 5.Masui S, Yonezawa A, Izawa K, Hayakari M, Asakura K, Taniguchi R, Isa M, Shibata H, Yasumi T, Nishikomori R, Takita J, Matsubara K.
  • Journal Title: J Pharm Health Care Sci. Volume: May 2;5:9 Pages: eCollection
  • DOI: 10.1186/s40780-019-0136-4
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Low-frequency mosaicism in cryopyrin-associated periodic fever syndrome: mosaicism in systemic autoinflammatory diseases. (2019)
  • Author(s): Nishikomori R, Izawa K, Kambe N, Ohara O, Yasumi T.
  • Journal Title: Int Immunol. Volume: Sep 18;31(10) Pages: 649-655
  • DOI: 10.1093/intimm/dxz047.
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 1.不明熱診療における末梢血1型インターフェロン応答遺伝子群の発現解析の有用性, (2019)
  • Author(s): 宮本 尚幸,本田 吉孝,井澤 和司,前田 由可子,西谷 真彦,仁平 寛,柴田 洋史,田中 孝之,八角 高裕,滝田 順子,西小森 隆太
  • Organizer: 第29回日本小児リウマチ学会総会・学術集会
• [Presentation] 2.MEFV V726A/I692del複合ヘテロ接合性変異を認め、自己免疫性肝炎を併発した家族性地中海熱の一例 (2019)
  • Author(s): 宮本 尚幸,井澤 和司,田中 孝之,前田 由可子,西谷 真彦,仁平 寛士,本田 吉孝,柴田 洋史,八角 高裕,滝田 順子,西小森 隆太
  • Organizer: 第29回日本小児リウマチ学会総会・学術集会
• [Presentation] 3.多彩な自己炎症性疾患を紐解く インフラマソームを介した自己炎症性疾患の診断・治療にiPS細胞がどのように役立つか? (2019)
  • Author(s): 田中 孝之,芝 剛,西小森 隆太,柴田 洋史,井澤 和司,柳町 昌克,齋藤 潤,中畑 龍俊,小原 收,平家 俊男,滝田 順子,八角 高裕,
  • Organizer: 第29回日本小児リウマチ学会総会・学術集会
• [Presentation] 4.免疫不全 原発性免疫不全症の遺伝子診断におけるExome解析のpitfallと診断困難例に対する解析戦略 患者由来iPS細胞を用いて診断したDeep intron変異による細胞種依存的なNEMO異常症の経験から (2019)
  • Author(s): 本田 吉孝,八角 高裕,伊佐 真彦,仁平 寛士,芝 剛,柴田 洋史,田中 孝之,井澤 和司,川崎 ゆり,齋藤 潤,網代 将彦,萩原 正敏,岡田 賢,小原 收,平家 俊男,滝田 順子,西小森 隆太
  • Organizer: 第47回日本臨床免疫学会