2020 Fiscal Year Research-status Report
The study to elucidate the background of molecular genetics that cause holoprosencephaly spectrum disorders the diversity of phenotype
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19K17320
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
阿部 裕 東北大学, 医学系研究科, 非常勤講師 (00789787)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | Holoprosencephaly / 全前脳胞症 / Binder症候群 / Binderoid cleft lip |
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| Outline of Annual Research Achievements |
令和2年度は症例の収集を進めながら解析を継続した。対象症例は年齢・性別を問わず、臨床症状として口唇顎口蓋裂・眼窩間距離の狭小化など、顔面正中部の低形成による顔貌異常を伴う症例とした。新たに鶴岡市立荘内病院で1例の典型的なHPE症例(LOBAR型)と1例のBinderoid complete cleft lip/plate疑い例を同定した。対象症例は令和2年度末までに、宮城県立こども病院・八戸市立市民病院・鶴岡市立荘内病院から典型的なHPE症例3例、東北大学病院・鶴岡市立荘内病院からBinderoid complete cleft lip/plateとその疑い例 18 例となった。
その中のHPE症例3例 (ALOBAR型1例、SEMILOBAR型1例、LOBAR型1例)、Binderoid complete cleft lip/plate症例2例において、患者もしくは家族よりインフォー ムドコンセントを取得し、患者本人、および両親から採血を実施した。5症例に対してG-bandingを行い、いずれも正常核型であることを確認した。続いて、既知の遺伝子変異の同定、及びHPEの発症に関わる主要なpathwayに含まれる遺伝子の変異を同定するため、Targeted NGS panelを実施した。148の候補遺伝子のエクソン領域、およびECR browserを用いて同定した非コーディング領域のevolutionarily conseved reigion (脊椎動物において種を超えて保存されている領域)を解析領域とした。以上を含めた全975,605bp対象領域とし、Hiseq2000を用いてシークエンスした。そのうち八戸市立市民病院で同定されたALOBAR型のHPE症例で既知の原因遺伝子SIX3にde novoのフレームシフトを同定した。残りの4症例については解析を継続中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究の遂行にあたっては、東北大学大学院医学系研究科倫理委員会の承認を得た (「研究課題:次世代シークエンサーを用いた網羅的解析による全前脳胞症の遺伝子解析研究」、受付番号: 2017-1-195)。症例収集については当院および関連病院に周知し、現在までに、典型的なHPE3症例、Binderoid cleftlip/plateを含 む18例が同定された。その中のHPE症例3例(ALOBAR型1例、SEMILOBAR型1例、LOBAR型1例)、Binderoid complete cleft lip/plate症例2例において、患者もしくは家族よりインフォー ムドコンセントを取得し、患者本人、および両親から採血を実施した。5症例に対してG-bandingを行い、いずれも正常核型であることを確認し、148の候補遺伝子についてTargeted NGSを実施中である。当初の予定では令和2年度中に既知の遺伝子変異の同定、及びHPEの発症に関わる主要なpathwayに含まれる遺伝 子の変異の同定までを想定していたが、現時点でそこまでは到達していない。本研究を遂行するにあたり、個々の症例に対する本研究参加へのインフォームドコ ンセントに十分な時間をあてているため、検体および臨床症状の収集に想定よりも時間を要している。今後も引き続き十分な説明を行い、インフォームドコンセ ントを得た上で研究を遂行する方針である。
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| Strategy for Future Research Activity |
収集した症例に対し、引き続き以下の順序で解析を進める。
(1) G-banding:13トリソミー・18トリソミー・三倍体など染色体の数の異常の検索のために行う。末梢血中の分裂中期(metaphase)の白血球のギムザ染色により 染色体を観察する。状況に応じて、当院あるいは協力病院にて施行する。(2) CGHアレイ、MLPA(Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification):染色体の 微小な欠失・重複、及びCopy Number Variantの検索のために行う。CGHアレイ解析はAgilent Technologiesの180K+SNP用の解析キットを用いて行う。 Microarray Scanner、サーマルサイクラーなどの機器は、当院当科で所有しているものを使用する。(3) Targeted NGS assay:既知の遺伝子変異の同定、及び HPEの発症に関わる主要なpathwayに含まれる148遺伝子の変異を同定する。これらのエクソン領域 (コーディング領域、UTR)に加えて、ECRbrowserを用いて同定 した非コーディング領域のevolutionarily conseved reigion(ECR:脊椎動物において種を超えて保存されている領域)を解析領域に含める。上記の解析(G- banding、CGHアレイ、MLPA、Targeted NGS assay)で原因が同定されなかった症例についてはトリオ(発端者と両親)に対し全エクソームシークエンスを施行し、 未知の遺伝子変異の同定を試みる。
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| Causes of Carryover |
この研究では、MLPA法で用いるサーマルサイクラーやシークエンサー(次世代シークエンサー)、CGHアレイ法に必要なスキャナーなどの大型機器は当研究室、お よび遺伝医療学分野研究室や東北大学医学部共同実験室にあるものを使用するため計上しない。よって必要なのは主として遺伝子解析に必要な実験試薬、 プラ スチック備品、データの保存解析等に使用するPCなどである。当初令和元年度に計上していたエクソームシークエンス用のHuman エクソームキットベイト ライ ブラリー(16 サンプル分kit)、CGH マイクロアレイ用のCGH microarray kit(180K CGH+SNP) (10 サンプル分)、MLPA用のプローkit(100reaction)、 DNA抽出など その他の試薬代とプラスチック備品代を令和2年度に計上する。同じく、CGH アレイによる解析では1 検体の解析に約70 千円程度、次世代シークエン サーを用 いた解析は1 検体の解析に約100 千円程度必要となるためそれらを令和2年度に計上する。 当院以外の病院における倫理委員会やインフォームドコンセントに関 する経費、また、国内の学会や研究会に参加し、あるいは論文作成して研究についての報告を行い、更なる症例収集を行うため、旅費やその経費を必要とする。
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Research Products
(1 results)
