2020 Fiscal Year Research-status Report

神経芽腫がん幹細胞マーカーALDH1A2によるがん微小環境の制御の解明

Research Project

Project/Area Number	19K17331
Research Institution	Kobe University
Principal Investigator	植村優神戸大学, 医学部附属病院, 助教 (40814348)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	がん幹細胞 / ALDH / 神経芽腫
Outline of Annual Research Achievements	高リスク神経芽腫の予後改善を目指した多くのがん幹細胞研究が、国内外で活発に行なわれている。本研究では、神経芽腫細胞の分泌因子という視点から研究を行っている。19アイソフォームからなるアルデヒド脱水素酵素(ALDH)は、最も古くから知られている汎用的ながん幹細胞マーカーであるが、個々のがん種において働くアイソフォームおよびその機能には、未だ不明な点が多い。これまでに申請者らは、神経芽腫がん幹細胞(CSC)の増殖・分化を制御し、神経芽腫患者の予後と有意に相関した発現を示すALDH1A2アイソフォームを同定している。さらに、ALDH1A2アイソフォームをノックダウンおよび過剰発現した神経芽腫BE(2)-C細胞を樹立し、ALDH1A2が神経芽腫のCSC形質をin vivo（ヌードマウス）でも制御することを示している。本研究では、ALDH1A2の作用機構の解明を目指して、ALDH1A2によって分泌を制御される分子の同定を試みている。ALDH1A2をノックダウンおよび過剰発現した神経芽腫BE(2)-C細胞の培養上清を用いて、両者の間で発現量（分泌量）の異なる分子を探索し、いくつかの候補となる分子を同定することができた。これらの候補分子の培養した神経芽腫細胞内における発現をmRNAおよびタンパク質レベルでの局在については証明を終えた。またこれらの分子を加えることで神経芽腫細胞株増殖を明らかにすることができた。現在はこれらの分子が神経芽腫がん幹細胞、神経芽腫間葉系幹細胞、がん関連線維芽細胞に対する相互作用についての解明を試みている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason ALDH1A2によって分泌を制御される分子の同定には、ALDH1A2をノックダウンおよび過剰発現した神経芽腫BE(2)-C細胞の培養上清をSDS-PAGE後、銀染色上の濃さが大きく変化したバンド群を質量分析（Mass Spectrometory)し、同定できた。これらの候補分子の培養した神経芽腫細胞内における発現をmRNAおよびタンパク質レベルでの検討を終えている。
Strategy for Future Research Activity	同定した候補分子の細胞内局在を、間接蛍光免疫法を用いて形態学的に解析していく。局在の変化を検出できれば、GFP融合蛋白質を用いたライブセルイメージングによって細胞内動態を詳細に検討していく。次に、同定した候補分子を過剰発現およびノックダウンしたBE(2)-C細胞を作製し、DNA合成、細胞増殖速度、細胞運動能、軟寒天培地コロニー形成能、スフェア形成能をコントロール細胞との間でin vitroで比較検討していく。同時に、ヌードマウスを用いてin vivoでの腫瘍形成能、転移能についても検討していく。