2019 Fiscal Year Research-status Report
The origin of supernumerary ribs focused on rat strains
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19K17339
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| Research Institution | Ohu University |
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Principal Investigator |
熊本 隆之 奥羽大学, 薬学部, 講師 (00433558)
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2019-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 過剰肋骨 / 催奇形性 / 先天異常 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまでに我々は過剰肋骨の機序解明を目的とし、妊娠9日フルシトシン(5FC)投与で過剰肋骨の出現とともに胸椎腰椎境界部でHoxa10の後方化を認め、さらに妊娠13日投与で後肢のHox11-13の発現減少とともに四指形成に異常をきたすことを見出し報告してきた（Kumamoto et al., Fundam. Tox. Sci. 2020他）。
一方、四指の異常は重篤であり、Cyclin群の変動も認めたことから、その系統差から過剰肋骨の毒性学的意義の考察を行う前段階として5FCのアポトーシス誘導の可能性を探るため、in vitro評価を実施した。
まずラット胎児由来線維芽細胞の培養系を確立し、24h薬物処理後のレサズリン細胞生存率アッセイ、リアルタイムPCRによるCyclin遺伝子群発現、フローサイトメトリーによるFITC/PIアポトーシスアッセイを実施。その結果、陽性対照5FUに見られる変動が5FCで認められず、5FCによる骨格異常は直接的なアポトーシス誘導によるものではないことが示唆された（第60回先天異常学会発表予定）。
続いて系統差の遺伝学的な検出を行うため、予備検討としてSD系・Wistar系の妊娠ラットを各１匹購入、その胎仔尾部よりgenome DNAを抽出、hot start PCRによる増幅を行い、カラム法によるプライマー除去を行った後、DNAシーケンス解析を行った。Hoxa9, a10の全エクソンおよびプロモーター領域の解析を行い文献情報との比較検討を完了した。
さらに本実験として妊娠ラットを各４匹購入、全胎仔のサンプリングを完了し、シーケンス解析を進めている段階にある。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
予定通りおおむね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
系統差のDNAシーケンス実験を完了させ、ClustalW等による比較解析を実施する。その結果に応じ、同一胎仔の胸椎部／腰椎部のリアルタイムPCR解析（サンプリング済）、メチル化シーケンス解析等を行う。
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| Causes of Carryover |
多くの予算を要するDNAシーケンス解析に先立ち培養細胞実験を実施したことによる。DNAシーケンス解析を次年度予算で実施する。
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