2019 Fiscal Year Research-status Report
mRNA-Seq解析を用いた難治性小児てんかんKCNQ2脳症の治療薬候補探索
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19K17347
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| Research Institution | Fukuoka University |
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Principal Investigator |
柴田 磨己 福岡大学, 公私立大学の部局等, ポスト・ドクター (20816392)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | KCNQ2遺伝子変異 / RNA-Seq / てんかん / in silico スクリーニング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、以下の3つを目標としている; 1) KCNQ2脳症患者由来の遺伝子変異を保有するKCNQ2脳症モデルマウス(KCNQ2脳症マウス)を用いてKCNQ2脳症特異的な遺伝子発現変化を同定すること、2) 分子シミュレーションによって化合物データベースから治療薬候補を探索すること(in silicoスクリーニング)、3) 同定されたKCNQ2脳症特異的な発現変化を指標としながらKCNQ2脳症マウスへの化合物投与実験を行い、有力なKCNQ2脳症治療薬候補を同定することを目的としている。
本年度は1)の目的のため、幼若期から成体期までの、生後8、12、16、20、32、64日にあるKCNQ2脳症マウス、および野生型マウスでmRNA-Seq解析を実施する計画であり、現状、全日齢のマウス海馬組織の採取を完了した。次年度は、これらの組織からRNAを抽出し、mRNA-Seq解析を実施する。
また本年度は、2) を目的として計画したin silicoスクリーニングを実施した。Molecular Operating Environment (MOE: 株式会社富士通九州システムズ、株式会社MOLSIS提供)ソフトウェア上で分子モデリングを行い、KCNQ2遺伝子がコードするKv7.2を含む全種のカリウムイオンチャネルの三次元構造を作製した。また、作製した構造と4,907,448件の化合物構造(キシダ化学株式会社データベース)とでドッキングシミュレーションを行い、脳組織で主要に発現しているKv7.2/Kv7.3チャネルに、優先的に結合することが予測される計20件の化合物を選出した。次年度は3)を目的とし、KCNQ2脳症マウスに選出した化合物を投与し、カイニン酸誘導発作症状の軽減、および海馬組織内の分子変化等を検証する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度は生後8、12、16、20、32、64日の計6つの日齢にある野生型マウス、およびKCNQ2脳症マウスの海馬組織でmRNA-Seq解析の実施を予定していた。しかしながら、度々、KCNQ2脳症マウスが必要日齢まで達せず、原因不明のまま突然死しため、組織採集が遅延しシーケンシング実施には至らなかった。一方で、3年目に予定していたin silicoスクリーニングによる治療薬候補化合物の選出は、概ね順調に進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
次年度以降は、採集した海馬組織でmRNA-Seq解析を実施する。日齢ごとに野生型マウスとKCNQ2脳症マウスの遺伝子発現パターンを比較し、KCNQ2脳症マウスにおいて、顕著に発現変化、またはスプライシング変化が生じていた遺伝子を網羅的に同定する。また、発現変化遺伝子数が顕著に多かった日齢のKCNQ2脳症マウスに対して、in silicoスクリーニングによって選出された化合物を投与し、カイニン酸誘導発作症状の改善かどうか、また、化合物投与による海馬組織内の遺伝子発現変化、タンパク質量変化について調査する。
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| Causes of Carryover |
本年度はmRNA-Seq解析実施のための組織採集を行ったが、組織採集に必要な実験器具、試薬は現有していたため、この作業に関する支出は無かった。また、本年度はmRNA-Seqのシーケンシング委託費用を計上していたが、組織採集が遅延しシーケンシングには至らなかったため、この費用の支出も発生しなかった。
また、本年度はin silicoスクリーニングも実施したが、必要なソフトウェアの契約は前年度より継続しており、化合物データベースも無償提供であったため、この作業に伴う支出も発生しなかった。
次年度の費用は本年度計上していた費用と合わせ、本年度計画していたmRNA-Seq解析、および分子生物学実験、動物実験の実施に使用する。
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