2020 Fiscal Year Research-status Report

Immune escape and exhaustion attributing to development of PTLD

Research Project

Project/Area Number	19K17352
Research Institution	National Center for Child Health and Development
Principal Investigator	山田全毅国立研究開発法人国立成育医療研究センター, 高度感染症診断部, 医長 (30445316)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	Epstein-Barr ウイルス / リンパ増殖性疾患 / Transcriptome
Outline of Annual Research Achievements	当該年度の実績として、本実験モデルの詳細な検証、小腸移植後患児におけるEpstein-Barr virus (EBV）関連リンパ増殖性疾患（LPD）の病態解析と英文論文化、が挙げられる。一方で、他の研究グループより、競合する結果が学術誌に発表されたことを受け、本研究計画の見直しも迫られ、実験モデルを変更する必要性が生じた。総じてみると免疫学的制御の破綻に注目したLPDの病態解明の研究状況は、当初の予定より若干の遅れがある、といえる。本研究の目的は、臓器移植後のEBV－LPDの発症における免疫応答メカニズムの解明である。この目的を達成するために、ヒト化マウスを使用し免疫抑制薬投与下でEBVを感染させる、というモデルを用いて、EBV感染B細胞および、それらに対して応答しているT細胞の解析を行った。しかし、免疫応答を評価の対象として、想定していたT細胞はヒト化マウス内で異常な形質を示し、本研究の目的には沿わないことが判明した。さらにEBV感染B細胞が免疫抑制薬の投与下でよりLPDに進展しやすい、という報告が2020年にほかのグループよりなされたこともあり、当初の計画を一部見直す必要が生じた。そこで我々は、免疫不全マウスをもちいた、疾患モデルの内容を変更して、まれなEBV感染NK細胞が、LPDへと進展する過程で、どのように免疫回避機構を利用しているか、に注目しながら病態の解析を進めている。新たに作成したEBV感染NK細胞増殖性疾患のモデルでは、EBV感染細胞の形質が、患者(ドナー)のそれに類似することがわかった。今後、モデルで再現されたEBV感染細胞とドナーのEBV感染細胞の詳細を転写因子レベルで解析、比較することで、特に免疫回避のメカニズムを中心とした、LPDの発症・進行にかかわる因子を同定し、EBV－LPDの病態解析を継続する予定である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 本研究の目的は、臓器移植後のEBV－LPDの発症における免疫応答メカニズムの解明である。これまで、ヒトのEBV感染細胞が多様性を有すること、末梢血と組織中の感染細胞の形質が異なることなどをヒト検体により明らかにしたが、これらのEBV感染細胞に対する応答をより詳細に解析するためにヒト化マウスEBV感染モデルを使った研究を進めてきた。このヒト化マウスEBV感染モデルに免疫抑制薬（タクロリムス）を投与した場合、EBV 感染細胞とそれらに対する免疫細胞の応答がどのように変化し、LPDの発症に至るか、の解明が本研究の中心となる学術的な問いであったが、研究を進める中でヒト化マウスモデルにおける免疫応答の詳細な解析は困難であることがわかってきた。免疫不全マウスに移植したヒト末梢血CD34＋細胞はマウスの体内で主としてリンパ球に分化し、生着する。一方で我々が用いたモデルでは、ナイーブT細胞の生着を得ることができなかった。これはマウスの胸腺における生着ヒトT細胞の分化が不十分であること、異種の組織に対して免疫応答を起こしてしまう、すなわち移植片対宿主病をおこしてしまうことが原因であると推測された。結果として得られたT細胞はすべからく細胞疲弊の進行したPD-1+T細胞であることが分かった。さらにCaduffらにより、HLA-A2免疫不全マウスにEBVを感染させ、タクロリムスを投与することで、EBV感染B細胞がLPDをより発症しやすくなることが、2020年に報告された。本論文の実験手法は、ヒト化マウスモデルにEBVを感染させ、免疫抑制薬を投与する、という点で、我々の実験系に酷似しており、また、生着したT 細胞の形質や機能の評価が容易でないことも示した。このため本研究計画は、新規性を追求するという観点から、変更を余儀なくされた。
Strategy for Future Research Activity	上記の状況を踏まえて、本研究では、非B細胞型EBV感染細胞におけるLPDへの進行とそれに関連する免疫回避機構の解明に重点を移すこととした。ヒト化マウスにEBVを感染させる手法では、NK細胞やT細胞などの非B細胞型EBV感染が起きないことを踏まえ、これらの病態を有する患者（ドナー）の末梢血単核細胞（PBMC）を用いた、patient-derived xenograft (PDX)モデルの作成に着手し、作成に成功した。ここで用いたのは、二つの異なる臨床像を呈するドナーから得た、PBMCを用いてヒト化マウスを作成するという手法である。この方法で得られたEBV感染NK細胞の数や性状の一部は、ドナーのそれを反映していた。このため、異なる細胞増殖能や臨床的悪性度を評価する目的で、分離NK細胞の網羅的転写因子解析を行った。今後、得られた解析結果をもとに、異なるドナーのEBV感染NK細胞に元来生じている悪性度の違いを探求するためにドナーのsingle cell RNAシークエンスを行い、モデルで得られた所見と、実際の患者で起きている現象の共通点・相違点に注意しながら、LPDの発症や進行に関する病態の解明を継続する予定である。
Causes of Carryover	従来のヒト化マウスの作成手順では、EBV感染細胞に応答するT細胞を認めるものの、正常に分化・増殖しえないことがわかった。このため実験計画の中心をEBV感染細胞の免疫回避のメカニズムに据えなおし、修正を加える必要が生じた。これらの変更により、T 細胞の疲弊を解析するフローサイトメトリー試薬等の費用が予定より少額となった。また新型コロナウイルスの蔓延により学会参加はwebに限られたためこれらの費用も少額となった。一方で、PDXモデルの導入により、EBV感染NK細胞の生着による病態の再現を試みたところ、臨床像の異なる患者から、それぞれ悪性度の異なるEBV感染NK細胞LPDが再現可能であった。悪性度の異なるLPD患者からえた、PDXモデルを用いることにより、免疫回避機構を含めて異なる悪性度を規定する因子を探索する必要があることから、現在、繰り越し予算分を用いて、分離NK細胞に対するRNA seqを行っており、またこれらのドナー（つまりは患者）の末梢血単核細胞を用いてsingle cell RNA seqを行い、モデルの妥当性を確認するとともに、実際のヒトの体内で起きているLPDとそれを取り巻く免疫環境の解析を行う予定である。