遺伝性神経変性疾患に認めるtRNA由来小RNAの生理的・病理的意義の解明

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K17366
• Research Institution: Oita University
• Principal Investigator: 井上 真紀 大分大学, 医学部, 助教 (20726913)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 橋小脳低形成 / tRNA fragment / 神経細胞死 / p53 / PKM2

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、CLP1遺伝子変異によって発症する橋小脳低形成10型における神経変性の病態分子機構の解明を目的としている。CLP1はtransfer RNA（tRNA）代謝に関連するRNAキナーゼであるが、CLP１の機能異常によりtRNA由来の小RNA(tRNA fragment)が細胞内に蓄積することが分かっている。申請者は、CLP1遺伝子変異により細胞内に蓄積するtRNA fragmentのうち、チロシンtRNA前駆体から生じる5 '側のエクソン断片（5' Tyr-tRF）ががん抑制因子p53の過剰な活性化を介して神経細胞死を惹き起こすことを見出した。更に5' Tyr-tRFはPKM2に直接結合することで神経細胞に影響を及ぼすことを明らかにした。
当該年度においては5' Tyr-tRFが神経発生中のどの段階に影響を及ぼすのかについて、in vivoモデルを用いて、TUNEL assayやWole mount immunostainingにより解析した。one cell stageの遺伝子改変ゼブラフィッシュTg(islet1:GFP)胚に5' Tyr-tRFをinjectionし、whole mount染色を行い、経時的に神経のアポトーシスについて評価した。ゼブラフィッシュの分化した神経細胞において、TUNEL陽性細胞を認め、5' Tyr-tRFは分化した神経細胞にアポトーシスを誘導していることを明らかにした。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

2020年度は、5' Tyr-tRFによる神経細胞がアポトーシスによるものかについて検討した。神経特異的にGFPの蛍光がみられる遺伝子改変ゼブラフィッシュTg(islet1:GFP)を用いることで、whole mountでゼブラフィッシュを染色し、経時的な評価が可能であった。

Strategy for Future Research Activity

5' Tyr-tRFがp53の過剰な活性化を介した神経細胞死を起こすメカニズムにおいて、PKM2の関与を示唆され、更にその神経細胞死はアポトーシスが誘導されていることが判明した。今後は5' Tyr-tRFがPKM2に結合すると、どのようにp53が活性化されるのかについて検討を行う。またCLP1遺伝子変異による神経細胞死にPKM2が有効に働くかを調べていく。

Causes of Carryover

コロナウイルス流行下のため、学会発表用の経費として計上していた分が余った。研究が順調であり、in vivo解析がかなり進んだため、tRF毒性をin vitroでいくつかの種の細胞株を用いた解析実験を追加し、研究の裏付けを強めることを予定しているので細胞培養や抗体購入費として次年度に使用する。