2021 Fiscal Year Research-status Report
The establishment of early diagnostic method for glucose transporter-1 deficiency syndrome
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19K17374
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| Research Institution | Jichi Medical University |
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Principal Investigator |
中村 幸恵 自治医科大学, 医学部, 講師 (20382955)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | グルコーストランスポーター1欠損症 / GLUT1 / SLC2A1 / 遺伝子治療 / AAV |
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| Outline of Annual Research Achievements |
【背景】グルコーストランスポーター1欠損症(Glut1DS)はSLC2A1遺伝子変異により、脳内GLUT1を介した糖取込障害をきたし、難治性痙攣、知的障害、小脳失調等を引き起こす。従来の診断は、髄液採取による髄液糖の低下で疑い、原因遺伝子SLC2A1の遺伝子解析で確定するが、早期にGlut1DSと診断し、かつ重症度が予測出来れば、神経細胞や脳内微小血管のダメージをきたす前に治療に進むことが出来る。新生児期でも採取可能な微量血液でフローサイトメトリー法にて赤血球細胞膜上のGLUT1蛍光強度を評価し、臨床的な重症度と比較検討する。
【方法】研究に同意が得られた、Glut1DS確定診断後患者およびGlut1DS疑い患者について、全血採取から24時間以内に赤血球分画を分離し、そのうち1μlを使用しフローサイトメトリー法を行う。フローサイトメトリー用GLUT1抗体として、GFPタグ付Glut1.RBD(GLUT1-G100; METAFORA; GLUT1構造内のアミノ酸425-432領域を認識するリガンド試薬）を用いる。測定機器はBD LSRFortessa X-20 フローサイトメーターでCD235a＋GLUT1＋細胞を分離しヒストグラムでピーク値を比較する。
【結果】2021年度は、SLC2A1遺伝子変異検索によりGlut1DS確定診断されている1名（ナンセンス変異、重症)および、臨床症状からGlut1DSを疑った1名（中等症）の計2名について解析を行った。GLUT1蛍光強度は健常者が平均97%に対し、ナンセンス変異患者が87.6%と低下していた。中等症患者については、88.8%と低下し、後に遺伝子解析でSLC2A1遺伝子のミスセンス変異(c.997C>T, p.Arg333Trp)と判明した。遺伝子変異検索より迅速に病型診断出来た症例となった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
2021年度も、COVID19流行が続き、電話再診に切り替えた患者が多く、実際に病院受診をした上で、同意が得られ採血した患者が減少した。そこで、第12回国際協力遺伝病遺伝子治療フォーラム参加し、グルコーストランスポーター1欠損症に対する遺伝子治療について報告した際に、フローサイトメトリー法によるスクリーニングについても周知した。2021年度は、遺伝子検索が遅れた患者にフローサイトメトリーを行うことで診断に結び付いた症例があり、検査の有効性を示すことは出来た。
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| Strategy for Future Research Activity |
①フローサイトメトリー法によるGlut1DS患者の赤血球細胞表面のGLUT1発現の評価：重症度を分類するカットオフ値を決定することを目標に引き続き研究を進める。2021年度までに既に14例の測定実績があり、2022年度は、日本小児科学会(2022年4月)、日本小児神経学会(2022年6月)に研究成果を報告を予定している。
②大型実験動物に対する治療用AAVベクター投与経路の評価：申請者は、Glut1DSに対するAAVを用いた遺伝子治療をテーマに研究を継続しており、ミニブタに対するGlut1DS治療用AAVベクター（ヒト内在性GLUT1プロモーター組込治療用AAVベクター: AAV-GLUT1)髄腔内投与については、治療4週間後の外因性GLUT1発現を確認した(Nakamura S et al. Gene Therapy 2021)。現在、Glut1DS遺伝子治療の医師主導型臨床治験に向けて準備を進めており、同時に他の神経性遺伝性希少難病に対する遺伝子治療開発を目標としている。その過程でより侵襲性が低く、より効果的な投与経路の検討が必要になると考えた。2022年度は、正常ミニブタに対し、蛍光蛋白発現カセット(AcGFP, mCherry, AmCyan)を組みこんだAAVベクターを大槽投与、脳室内投与、静脈投与を同時に行い、蛋白発現の評価を行う。
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| Causes of Carryover |
COVID19流行により、学会がハイブリッド開催となり、Webで参加したため、旅費支出がなくなった。また、フローサイトメトリー用試薬について、2021年度は販売休止となり、2020年度までに購入した試薬で研究を継続せざるを得ない状況となり、新規購入の抗体費として確保していた予算の支出がなくなった。試薬については2021年度は残薬があり、研究の中断には至らずに済んだ。2022年度は、今までの研究成果を発表する国内学会が既に2件あり、（日本小児科学会；2022年4月、日本小児神経学会；2022年6月）年度後半には国際学会での発表を予定している為、学会参加旅費が増加する。研究用試薬についても、販売再開した際には新規購入し、検体数増加を予定している。同時に、研究推進方策②に記載した、大型実験動物に対する治療用AAVベクター投与経路の検討については、2022年前半を予定しているため、発現評価目的の抗体試薬の購入が必要になる。
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Research Products
(1 results)
