2020 Fiscal Year Research-status Report
Role and clinical application of HSP47 in the treatment of Crohn's disease with intestinal stricture
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19K17398
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
本澤 有介 京都大学, 医学研究科, 特定病院助教 (90737884)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 炎症性腸疾患 / クローン病 / 腸管線維化 / Heat shock protein 47 / 細胞増殖能 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
クローン病(Crohn's disease: CD)腸管狭窄は腸管に線維化が生じ、その病態にはコラーゲンの産生亢進が関与している。我々はこのコラーゲン産生に必須の分子であるheat shock protein(HSP)47を介したコラーゲン産生が腸管線維化に関与していることを報告してきた。しかしながら、CDの炎症には様々な因子が関与し、HSP47を介した腸管線維化の詳細な機序解明は十分ではなく、線維化治療におけるHSP47制御の検討も今後の課題である。前年度はヒト筋線維芽細胞株(CCD-18Co)を用いて検討を行い、複数の炎症性サイトカインの共刺激(IL-1β+IL-17A, IL-1β+TNF-α)にてHSP47およびコラーゲンの産生が亢進することを確認した。また、患者背景ではCD腸管狭窄症例には家族性地中海熱の疾患感受性遺伝子であるMediterranean fever (MEFV)遺伝子の中でもE148QにSNPを有する症例が多いことに着目し、同患者より単離した末梢血単核細胞におけるInflammasomeと呼ばれる蛋白複合体の活性亢進およびIL-1βの発現亢進を確認した。本年度ではヒト手術検体より単離した腸管筋線維芽細胞(Intestinal subepithelial myofibroblasts：ISEMFs)でも検討を行うことが可能となった。結果は細胞株の検討と同様に複数の炎症性サイトカインの共刺激にてHSP47およびコラーゲンの産生が亢進することを確認した。また、ヒト手術検体(炎症・非炎症部位)におけるISEMFsの増殖能を検討し、非炎症部位に比較して炎症部位のISEMFsの細胞増殖が明らかに亢進していた。このことから、炎症由来のサイトカイン環境ではHSP47を介したコラーゲン産生の亢進に加えて高度の細胞増殖環境が線維化に関与している可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
前年度では困難であったヒト手術検体を用いた検討が可能となり、ヒト腸管組織より単離した腸管筋線維芽細胞(intestinal subepithelial myofibroblasts: ISEMFs)による検討を行った。ISEMFｓの検討では炎症性サイトカイン(IL-1β、TNF-α、IL-17A)およびその共刺激での検討を行い、細胞株の検討と同様に複数のサイトカインでの刺激がそれぞれの単独での刺激より明らかにHSP47およびコラーゲンの産生亢進を認めた。特にIL-1βにおいてはIL-17AもしくはTNF-αを加えた共刺激でその産生亢進が著しかった。また、手術検体における病理所見では、腸管の線維化に加えて多数の炎症細胞の増殖が確認された。この結果から、さらなる検討として炎症を有する環境下での線維芽細胞の細胞増殖能の評価が必要と考え、クローン病(Crohn's disease: CD)および潰瘍性大腸炎(Ulcerative colitis: UC)の手術検体(炎症部位・非炎症部位)のISEMFsを複数作成し、リアルタイム細胞アナライザーを用いて細胞増殖能の評価を行った。結果、CDおよびUCいずれのISEMFsにおいても炎症部位より作成されたISEMFsは非炎症部位より作成されたISEMFsに比して明らかに高度の細胞増殖能を有していた。前年度の血清における評価にてヒトCD血清にてIL-1βの亢進が認められたことを考慮するとIL-1βを主体としたコラーゲンの発現亢進に加えて複数の炎症条件がISEMFsの増殖を促し、線維化にも影響を及ぼしていることが示唆される結果であった。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度の結果ではIL-1βがクローン病(Crohn's disease: CD)の炎症状態において発現が亢進し、特に腸管狭窄型CDではInflammasomeを背景とした同サイトカインの関与がHSP47およびコラーゲンの発現亢進を来していることを明らかとした。本年度はさらに細胞株でなく、実際の手術検体より単離したヒト腸管筋線維芽細胞(intestinal subepithelial myofibroblasts: ISEMFs)によるIL-1βと線維化との関係を検討し、細胞株と同様の結果を得た。また、炎症条件におけるISEMFsの細胞増殖能のリアルタイム測定により、炎症下では同細胞が高度の細胞増殖能を有していることも判明した。今後は線維化の制御を目指した取り組みを考えているが、現時点ではヒトHSP47shRNAを用いてISEMFsにおけるHSP47のノックダウンを複数の手術検体を用いた条件設定行っている。しかしながら、ノックダウンにより細胞の増殖能の低下や細胞死を認めており、条件の設定が難しくなっている。これには手術検体ごとに炎症の程度が異なる影響もあると考えられた。この為、IBDモデルマウスであるIL-10ノックアウト(KO)マウスを用いた検討を予定している。方法としては同マウスは生後10-12週程度でCD類似の自然腸炎を発症することから、腸炎状態の腸管検体を用いてISEMFsを作成し、IL-1βを中心としたサイトカインでの検討および細胞増殖能について評価を行う。同マウスではある程度一定した炎症状態が期待されるためHSP47を介したコラーゲンの制御について検討を行う予定である。条件設定含め本検討にあたり当グループでは既にIL-10KOマウス、マウスHSP47shRNAを有していることから、ある程度迅速性をもって評価が可能であると判断される。
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| Causes of Carryover |
(理由)
本年度は前年度困難であったヒト腸管組織より単離した腸管筋線維芽細胞のhuman intestinal subepithelial myofibroblasts(ISEMFs)の検討を行うことが可能となったが、検体は手術検体を用いることができ、かつ培養に要する試薬やサイトカインは前年度と同様であったため新たな物品の購入が抑えることが可能であった。また、同検討のため当初予定していたマウスの検討を次年度に行う予定としたため、実験マウスを用いた検討に要する経費が一部軽減され、次年度使用額が生じた。
(使用計画）
次年度の研究遂行に必要とされる経費は前年度と同様に1)ヒト細胞株、ISEMFsの作成・解析のための各種抗体および試薬に加えて、2)実験マウスの飼育・管理、3)情報収集および成果発表のための旅費である。1) 各種抗体および試薬：サイトカインの刺激実験、インフラマゾームの解析や遺伝子解析に必要な試薬・抗体の購入が必要である。2) 実験マウスの飼育・管理：腸炎状態の解析が必要となり、またマウス腸管線維化の治療実験など多めの実験マウスの維持管理が必要となる。3) 情報収集および成果発表のための旅費：本研究に関する情報収集および成果発表のための旅費が必要になる。
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[Journal Article] Identification of an Anti?Integrin αvβ6 Autoantibody in Patients With Ulcerative Colitis2021
Author(s)
Kuwada T, Shiokawa M, Kodama Y, Ota S, Kakiuchi N, Nannya Y, Yamazaki H, Yoshida H, Nakamura T, Matsumoto S, Muramoto Y, Yamamoto S, Honzawa Y, Kuriyama K, Okamoto K, Hirano T, Okada H, Marui S, Sogabe Y, Morita T, Matsumori T, Mima A, Nishikawa Y, Ueda T, Matsumura K, Uza N, Chiba T, Seno H
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Journal Title
Gastroenterology
Volume: -
Pages: -
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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