歯髄幹細胞産生因子による腸肝臓器相関に着目した新規NASH治療法の開発

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K17457
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 伊藤 隆徳 名古屋大学, 医学部附属病院, 病院助教 (00827389)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: NASH / SHED-CM / マクロファージ / 星細胞 / 腸肝相関 / 抗線維化 / 歯髄幹細胞 / 肝硬変

Outline of Annual Research Achievements

本年度は、本若手研究の初年度ということもあり、申請時に平成31年度の目標としていた（1）NASH線維化モデル作製の確立、(2)それに対するSHED-CM治療効果の検証、を中心に検討を行った。(1) まず先行実験としてウェスタンダイエット食と高濃度糖水、また週1回の少量四塩化炭素(CCl4)腹腔内投与を行い、既報通り12週でNASH肝硬変が完成するかどうか確認した。12週後の肝HE染色では肝内に高度脂肪沈着と炎症細胞浸潤、肝細胞風船化、Azan染色においてF2-4相当の線維化を認め、モデル作製成功率は100%であった。(2)次に本モデルに対して、10-12週において0.5mLずつ作製したSHED-CMの尾静脈投与を行った。コントロールPBS投与群と肝組織における脂肪・線維化程度を比較したところ、SHED-CM投与群では肝脂肪化ないし肝線維化面積の有意な改善を認めた。肝組織のreal-time qPCR法にて肝内遺伝子発現を検討したところ、線維関連collagen1a(p=0.038)、炎症性M1マクロファージ関連iNOS・TNFα(p=0.028)の有意な低下を認めた。しかし線溶系MMP13やHGF、CD206、Arginase-1では有意差を認めたかった。in vitroにおいてSHED-CM下で培養したヒト不死化星細胞(Lx2)ではαSMA発現が抑制されており、SHED-CMの直接的な星細胞に対する活性化抑制効果が示された。これまでSHED-CMは炎症環境下のマクロファージに作用し、M2型ないし線維化抑制型に変化させることで効果を示すと考えられてきたが、本モデルにおいては投与群においてM2マーカー上昇は認められず、以前CCl4単剤肝線維化モデルにて確認されたMMP-13の上昇も認められず、SHED-CMでの線維化抑制効果はモデルによってメカニズムが異なる可能性がある。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

科研費採用前から先行実験としてモデル作製とその評価を行っていたため、現在まで当初の予定通り進行していると考えられる。また 令和2年度に行う予定であったメカニズム解析に関しても着手し始めている。

Strategy for Future Research Activity

来年度においては本研究におけるメインの解析のひとつである腸管相関におけるSHED-CM投与の治療的役割に関して、検討を進めたいと考えている。そのためにもまずはNASHマウスモデルに対するSHED-CMによる肝脂肪・線維化改善効果が確かなものか、再現実験を行っているところである。初年度同様に治療効果が認められるようであれば、更なる効果発現メカニズムの解析に進みたい。腸管透過性遺伝子マーカーに関して、治療群と非治療群で比較を行い、有意差があるようであれば腸内細菌を含む腸内環境の解析や、LPS-binding protein・肝TLR発現などを検討する。また同時にin vitroにおける星細胞に対するSHED-CM投与の効果に関して、SHED-CM刺激マクロファージとの共培養や星細胞へのその上清直接投与にて細胞間の反応を検討する予定である。

Causes of Carryover

必要時物品を購入していく過程で59,825円という残金が発生してしまい、不要な物品購入を行うよりも次年度に繰り越した方がよいと判断させていただいた。繰り越し残金は次年度に消化する予定である。