Investigation of host factors which regulate HBV replication using single cell RNA-sequencing

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K17488
• Research Institution: Osaka International Cancer Institute
• Principal Investigator: 中堀 輔 地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪国際がんセンター(研究所), その他部局等, 肝胆膵内科副部長 (60795160)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: B型肝炎 / アミノ酸代謝

Outline of Annual Research Achievements

慢性肝炎患者の肝組織ではHBs抗原陽性細胞とHBsAg陰性細胞は不均一に分布し、HBs抗原陽性領域ではHBs抗原陰性領域と比較し、pregenomeRNA (pgRNA)やcccDNAは有意に高い。そこで、肝癌手術切除検体非癌部のホルマリン固定パラフィン包埋組織を用い、HBsAg陽性領域およびHBsAg陰性領域における宿主の遺伝子発現を、次世代シークエンサーにて網羅的に解析した。発現に差異を認める宿主遺伝子を複数選定することができた。同定した遺伝子の中の1つはアミノ酸代謝に関連する遺伝子であり、本研究ではHBV感染によるアミノ酸代謝リプログラミングに注目している。
ヒト肝細胞キメラマウスより単離した初代培養ヒト肝細胞モデルでは、HBV感染により選定した遺伝子の発現は上昇し、感染細胞におけるアミノ酸代謝や培養上清中のアミノ酸は変化した。次に、同定した遺伝子の発現を抑制および亢進させ、B型肝炎ウイルスの生活環における意義を解析した。HBV感染後に遺伝子発現を抑制するとウイルス複製は抑制され、選定した遺伝子はウイルス複製の過程に関与していることが示唆された。また、HBV関連蛋白の一つであるHBxを肝癌細胞株に強制発現させると、同定したアミノ酸代謝関連遺伝子の発現は上昇した。一方で、HBsおよびHBc蛋白を強制発現させてもこれらの遺伝子発現は変化しなかった。
続いて、肝癌切除検体非癌部を用い、シングルセル解析を行う方針とした。予備実験として、転移性肝癌患者の切除組織非腫瘍部を用い、単一細胞を分離したところ、8.34*10e5個の細胞を単離することができ、生細胞率は82%であった。今後は、HBVを由来とする肝細胞癌患者の手術切除検体非癌部を用い、解析を行う。
以上より、HBV感染細胞では、HBxによりアミノ酸代謝のリプログラミングが起こり、ウイルス複製を制御している可能性が考えられる。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

コロナウイルス感染症蔓延に伴う研究活動の制限のため。

Strategy for Future Research Activity

次年度は、外科切除組織を用いた単一細胞解析を行い、初年度の解析結果の検証実験を行う。

Causes of Carryover

コロナウイルス感染症の蔓延に伴い、試薬の納品が遅れたり、研究活動が制限されているため、本年度に予定していた解析を次年度に行う。