セラミド含有exosomeを介した新規NASH進展メカニズムの解明

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K17497
• Research Institution: Nagasaki University
• Principal Investigator: 福島 真典 長崎大学, 病院(医学系), 助教 (80835596)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: パルミチン酸 / LPS / セラミド合成 / exosome

Outline of Annual Research Achievements

脂肪毒性の主要な原因となる飽和脂肪酸（パルミチン酸）と腸内細菌叢がもたらすリポポリサッカライド（LPS)が非アルコール性脂肪肝炎（NASH)の病態にどのように関与するかを肝細胞が分泌するexosomeの観点から研究している。
パルミチン酸刺激により肝細胞中のセラミド合成が増加すること、また肝細胞が分泌するexosomeが増加し、そのexosomeにはセラミドが豊富に含まれていることは以前の実験で確認されており、これに加えLPSの添加がセラミド合成やexosome分泌のさらなる増加につながるかを検証している。
仮説としてはLPSが脂肪酸からセラミドを合成するために必要な変換酵素であるSPTをTLR4を介して増加させると考えており、現在in vitroの実験として肝細胞株を用いて、パルミチン酸刺激をした細胞、LPS刺激を加えた細胞、両方の刺激を加えた細胞を用意し、様々な条件下でTLR4やSPTの変化を調べている。
具体的にはパルミチン酸濃度を100uM, 200uM, 300uM, 400uMと変え、12時間、16時間、24時間と作用時間も変化させ、SPT,TLR4のmRNAをqPCRを用いて測定している。LPSも同様に濃度を変化させ検証している最中である。パルミチン酸の添加によりTLR4のmRNAが上昇することは今回の実験で明らかになったが、現時点ではまだ、TLR4やSPTに最も影響を及ぼすパルミチン酸とLPSの濃度、作用時間の最適な条件は見いだせていない。引き続きさまざまな条件下での実験を繰り返し、TLR4、SPTのmRNAを測定し検証していく必要がある。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

現在細胞の条件やパルミチン酸、LPSの濃度、作用時間などさまざまな条件下での検証をおこなっており、最適な条件を決めるのに時間を要している。

Strategy for Future Research Activity

その後の実験にも影響を及ぼすため、パルミチン酸とLPSの最適な条件を確立することが重要である。そのため、繰り返し条件を変えて実験する必要がある。最適な条件を見いだせれば、その条件下でのexosomeの抽出、セラミドの測定へと実験を進められる。

Causes of Carryover

本年度の実験がやや遅れており、exosome抽出、解析に関する費用やセラミド測定などの費用が掛からなかったため、当初の計画より使用額が少なくなっている。翌年度に本年度に行えなかったexosome抽出に必要な超遠心用tubeやexosomeを証明する各種抗体の購入費、またexosomeとセラミド測定に対する解析費として使用する。