2020 Fiscal Year Research-status Report
家族性高コレステロール血症におけるiPS細胞由来肝細胞の細胞移植治療に関する検討
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19K17552
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
岡田 寛史 金沢大学, 附属病院, 特任助教 (10735161)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | iPS細胞 / 家族性高コレステロール血症 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
予定している検討課題としては、遺伝子修正iPS細胞を由来とする機能細胞に対するin vivoでの機能評価であり、LDL受容体ノックアウトマウスを使用した生体内でのLDL受容体機能に関する評価が挙げられる。また、これに付随してアポ蛋白の異常などについても評価を行い、細胞移植片による高LDLコレステロール血症の改善もしくは動脈硬化の進行抑制が可能かどうかについて検討する予定である。患者末梢血中リンパ球との共培養を行い、免疫反応による患者を由来とするリンパ球増殖により免疫反応を確認した。他者を由来とするiPS細胞を由来とする機能肝細胞は患者を由来とするiPS細胞から誘導した機能肝細胞と比較して強い増殖が見られたが、遺伝子編集を行ったiPS細胞を由来とする機能肝細胞は、患者を由来とするiPS細胞と同等であり、免疫反応がLDL受容体に対する遺伝子編集後も変わらないことを確認した。
今年度は、実験動物への細胞移植方法の検討をする予定であったが、コロナ禍などでの実験動物や機材の取得に遅れが生じたため、研究の進捗状況としてはやや遅れたものとなった。
HepG2細胞株を用いて細胞移植方法の検討を行う予定としているが、動物への移植実験系を確立するため、LDL受容体遺伝子をノックアウトしたHepG2細胞株の作製を行った。これらの細胞を利用して生着率の良い方法を採用する予定であるが、実験動物の用意に時間を要しているため、実験動物への細胞移植方法に関する検討は進んでいないのが現状である。そこで、遺伝子編集細胞株のDNA解析、細胞レベルにおけるLDL受容体の機能解析、qRT-PCRでの遺伝子発現解析などの実験を行い、移植方法を検討する際に使用する細胞としての妥当性に関して評価を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
ゲノム編集を行ったHepG2細胞株を用いて、ノックアウトマウスに対する移植実験を行い、生着率の良い方法を採用する予定であるが、実験動物搬入の手続き、必要とする匹数の確保に時間を要しているため、やや遅れている状況である。
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| Strategy for Future Research Activity |
実験動物の準備に時間を要しているが、用意出来次第、以下の検討を行う予定としている。
誘導肝細胞の移植方法の検討として、HepG2細胞株を用いてマウスへ直接腹腔内注入する方法や脾臓内もしくは上腸間膜静脈への注入など様々な方法に関して検討を行う予定とし、生着率の良い方法を採用する。生着率に関しては、血中ヒトAlb値などで評価を行う予定としている。また、採用した方法を用いてiPS由来とする誘導肝細胞をマウスへ移植し、高脂肪食を与え飼育しながら、血清LDLコレステロール値に対する降下作用及びリポタンパクを含めた詳細な脂質プロファイルを評価する。また、ラジオアイソトープを用いた実験を行い、生体内でのLDL取り込みについて詳細に評価する。
また、前年度行った実験結果よりiPS細胞を由来とする機能細胞の移植における安全性評価としては、軟寒天コロニー形成試験では評価が不十分であることが考えられるため、移植マウスにおけるテラトーマ形成の有無、細胞移植片に対する遺伝子発現解析などを行い、安全性に関して評価を行う予定とする。また、移植細胞の長期生着率および動脈硬化に関する評価としては、移植後マウスを8～12週間程度高脂肪食で飼育後、大動脈や大動脈弁周囲の動脈硬化巣形成の有無および動脈硬化の定量評価を行い、非移植後マウスと比較することで動脈硬化進行抑制作用について検討する。
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| Causes of Carryover |
前述の如く実験動物の搬入手続きに時間を要したため、動物実験そのものに関わる費用が少なかったことと、国内の学会での発表の機会が少なく、海外学会での発表の機会がなかったため、旅費として支出を予定していた費用に関する支出が無かったたことが理由として挙げられる。
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