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2019 Fiscal Year Research-status Report

エクソソームのオミックス解析情報に基づく新規心不全バイオマーカーの探索

Research Project

Project/Area Number 19K17583
Research InstitutionNational Cardiovascular Center Research Institute

Principal Investigator

錦織 充広  国立研究開発法人国立循環器病研究センター, オープンイノベーションセンター, 特任研究員 (00633645)

Project Period (FY) 2019-04-01 – 2021-03-31
Keywordsエクソソーム / 心不全 / バイオマーカー
Outline of Annual Research Achievements

日本では慢性心不全患者が急増しており、重症化した場合は予後不良となるため、早期介入と改善、重症化防止が不可欠である。その実現のため、迅速かつ高精度な重症度評価・予後予測法の開発が急務である。近年、様々な細胞が分泌するエクソソームが疾患病態を反映する非侵襲的マーカーとして利用できる可能性が示されてきた。そこで本研究では、心不全マウスの心筋組織から放出されるエクソソーム中のタンパク質・遺伝子より、心不全の病態を反映し重症度や予後予測などに利用可能な新規バイオマーカーを発見することを目的とする。心筋組織、血液から回収したエクソソームのオミックス解析情報を基盤として、心臓由来のエクソソームに特異的なマーカー分子を見出す。有望なマーカー分子については心不全患者の血液での測定、臨床情報や予後との相関解析を実施し、臨床応用を目指す。
本年度は、まず、心筋組織より放出されるエクソソームの回収法を検討した。マウスの心筋組織を細分化し、培地中で24時間静置した。その後、回収した培地から市販のエクソソーム精製キットを用いてエクソソームを回収した。得られたエクソソームのプロテオーム解析を行った結果、数百種類のタンパク質を同定することに成功した。エクソソームの精製純度に関しては、CD9などのエクソソームマーカーを認識する抗体を用いたウェスタンブロット、またはプロテオーム解析で同定されたタンパク質のエクソソームデータベースとの一致率により評価した。また、仔ラットより調製した初代培養心筋細胞の培養上清を回収し、同様にエクソソーム回収を実施した。培養液中のブロッキング剤の濃度や種類を検討し、エクソソームを効率的に回収できる条件を決定した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

心筋組織や血液から効率的にエクソソームを回収する方法については確立することができた。また、エクソソームのプロテオーム解析に関しても、基本的な解析方法を確立することができた。さらに、従来使用していたSCIEX社の質量分析計からBruker社の最新の質量分析計での解析に変更することで、1.5倍程度のタンパク質同定数が得られることも明らかとなった。一方で、エクソソームから精製したmiRNAのシークエンス解析については十分に実施することは出来なかった。まず、血液試料からエクソソームを精製した後、miRNAを回収する方法を検討した。miRNAの回収量についてはmiRCURYシステムを用いて評価を行ったが、当初、解析に十分なmiRNA量を確保することが出来なかった。そこで、サンプルの出発量やmiRNA精製キットの比較、精製時に用いるDNaseの反応条件を検討行った。この際、従来のqPCR法よりもデジタルPCR法を用いることで、より正確な定量が可能であることが明らかとなった。最終的にmiRNA-Seqでのパイロット的な測定を実施し、エクソソームから抽出したmiRNAで十分なリード数を得ることができ、解析可能であることを確認した。特にmiRNAでの解析条件の検討に想定よりも多くの時間が掛かったことを踏まえて、本研究は、やや遅れていると判断された。

Strategy for Future Research Activity

研究代表者は令和2年度より所属機関が福岡大学に変更となり、今後はミトコンドリアの機能や形態変化に関する研究に従事することとなった。ミトコンドリアはエネルギー産生を担う重要な細胞内小器官であり、心不全の多くの症例でエネルギー産生の低下やミトコンドリアのクリステ構造の変性などが起こっていることが明らかとなっており、研究代表者もこれまでの研究で確認している。そこで、次年度は心不全におけるミトコンドリアの異常に焦点を当てた解析を実施する。細胞内小器官からエクソソームが放出されるという報告はいくつかあり、ミトコンドリアからエクソソームと同様の細胞外小胞が放出される可能性は高い。心不全時に放出されるエクソソーム中に含まれるタンパク質や遺伝子の中に、ミトコンドリア関連タンパク質やミトコンドリアDNAの断片などを検出することが可能となれば、ミトコンドリアの変性やエネルギー産生低下を反映した新たな心不全マーカーを見出すことが可能になると考えられる。

Causes of Carryover

本年度はmiRNAシークエンスの条件検討に時間がかかり、当初予定していた解析試薬などを購入しなかったため、次年度使用額が生じた。次年度は研究代表者の所属が変更となり、ミトコンドリアに焦点を当てた解析を実施することになったため、当該助成金は新しい所属先で継続して研究を実施可能とするための小型機器や試薬、消耗品の購入費用に当てる予定である。

  • Research Products

    (11 results)

All 2019

All Journal Article (3 results) (of which Peer Reviewed: 3 results,  Open Access: 1 results) Presentation (8 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results)

  • [Journal Article] Wisteria floribunda agglutinin staining for the quantitative assessment of cardiac fibrogenic activity in a mouse model of dilated cardiomyopathy2019

    • Author(s)
      Nagai-Okatani Chiaki、Nishigori Mitsuhiro、Sato Takashi、Minamino Naoto、Kaji Hiroyuki、Kuno Atsushi
    • Journal Title

      Laboratory Investigation

      Volume: 99 Pages: 1749~1765

    • DOI

      10.1038/s41374-019-0279-9

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Lipidomic signatures of aortic media from patients with atherosclerotic and nonatherosclerotic aneurysms2019

    • Author(s)
      Saito Kosuke、Yagi Hiroaki、Maekawa Keiko、Nishigori Mitsuhiro、Ishikawa Masaki、Muto Sayaka、Osaki Tsukasa、Iba Yutaka、Minatoya Kenji、Ikeda Yoshihiko、Ishibashi-Ueda Hatsue、Ogino Hitoshi、Sasaki Hiroaki、Matsuda Hitoshi、Saito Yoshiro、Minamino Naoto
    • Journal Title

      Scientific Reports

      Volume: 9 Pages: e15472

    • DOI

      10.1038/s41598-019-51885-4

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] Receptor-binding affinities of bisphenol A and its next-generation analogs for human nuclear receptors2019

    • Author(s)
      Liu Xiaohui、Sakai Hiroki、Nishigori Mitsuhiro、Suyama Keitaro、Nawaji Tasuku、Ikeda Shin、Nishigouchi Makoto、Okada Hiroyuki、Matsushima Ayami、Nose Takeru、Shimohigashi Miki、Shimohigashi Yasuyuki
    • Journal Title

      Toxicology and Applied Pharmacology

      Volume: 377 Pages: 114610~114610

    • DOI

      10.1016/j.taap.2019.114610

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] 確率モデルに基づく質量分析におけるマススペクトルの解析2019

    • Author(s)
      橘 勇人, 高橋 篤, 錦織充広, 大星直樹
    • Organizer
      第18回情報科学技術フォーラム
  • [Presentation] 新世代ビスフェノールのヒト核内受容体に対するリスク評価2019

    • Author(s)
      劉 暁輝, 酒井大樹, 錦織充広, 巣山慶太郎, 縄司 奨, 池田 伸, 西垣内 誠, 岡田浩幸, 松島綾美, 野瀬 健, 下東美樹, 下東康幸
    • Organizer
      2019年度日本生化学会九州支部例会
  • [Presentation] Identification of Wisteria Floribunda Agglutinin as a Specific Lectin for Detection of Cardiac Fibrosis in a Dilated Cardiomyopathy Mouse Model Using Lectin Microarray-based Glycomic Analysis.2019

    • Author(s)
      岡谷千晶, 錦織充広, 佐藤 隆, 南野直人, 梶 裕之, 久野 敦
    • Organizer
      第83回日本循環器病学会学術総会
  • [Presentation] Proteome information-based disease staging pave the way to discover new biomarkers for evaluating development and progression of aortic aneurysm.2019

    • Author(s)
      南野直人, 八木寛陽, 錦織充広, 村上裕輔, 武藤清佳, 池田善彦, 植田初江, 森崎隆幸, 伊庭 裕, 佐々木啓明, 湊谷謙司, 松田 均
    • Organizer
      第83回日本循環器病学会学術総会
  • [Presentation] 心筋線維化の定量的評価法のための新規糖鎖マーカー開発に向けた、拡張型心筋症モデルマウス心臓のグライコーム、グライコプロテオーム解析2019

    • Author(s)
      岡谷千晶 , 錦織充広, 佐藤 隆, 南野直人, 梶 裕之 , 久野 敦
    • Organizer
      日本プロテオーム学会 2019年大会
  • [Presentation] Glycomic and Glycoproteomic Approaches for Development of Novel Glyco-Biomarkers of Cardiac Fibrogenesis Using a Mouse Model of Dilated Cardiomyopathy2019

    • Author(s)
      岡谷千晶 , 錦織充広, 佐藤 隆, 南野直人, 梶 裕之 , 久野 敦
    • Organizer
      第18回ヒトプロテオーム機構国際会議
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] 新世代ビスフェノールのヒト核内受容体に対する結合親和性評価(Binding affinity evaluation of next generation bisphenol for human nuclear receptors)2019

    • Author(s)
      劉暁輝,酒井大樹,錦織充広,巣山慶太郎,縄司奨,池田伸,西垣内誠,岡田浩幸,松島綾美,野瀬健,下東美樹,下東康幸
    • Organizer
      第92回日本生化学会大会
  • [Presentation] 新世代ビスフェノールのヒト核内受容体21種に対する結合親和性評価2019

    • Author(s)
      劉 暁輝, 酒井大樹, 錦織充広, 巣山慶太郎, 縄司 奨, 池田 伸, 西垣内 誠, 岡田浩幸, 松島綾美, 野瀬 健, 下東美樹, 下東康幸
    • Organizer
      第22回環境ホルモン学会 研究発表会

URL: 

Published: 2021-01-27  

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