in vivoイメージングによる虚血腎障害後の腎臓・肺内NETs動態の解明

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K17737
• Research Institution: Hamamatsu University School of Medicine
• Principal Investigator: 藤倉 知行 浜松医科大学, 医学部附属病院, 助教 (00444349)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: NETs

Outline of Annual Research Achievements

PAD4-GFPノックインマウス作製し、研究に供するに十分な頭数の繁殖に成功した。COSMIDより同定したsgRNAオフターゲット候補の上位7箇所に関してPCRを施行し、オフターゲットによる切断が無いことを確認した。ノックインマウスの外観上に大きな問題が無いことを確認し、急性腎障害後誘導の後の推移などから、ワイルドタイプと比してフェノタイプに大きな相違が無いことを確認した。
上記と並行して、ワイルドタイプマウスの末梢血を用いて、in vitroで3種類のNETsSuicidal NETs、Vital NETs、MitochondrialNETs)の誘導に成功した。GFP発現に最良な条件・観察時間の設定のため、種々の誘導薬物濃度・観察時間を設定し、それぞれのNETs誘導率・細胞生存率を観察した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

PAD4-GFPノックインマウス作製・繁殖、オフターゲットによる非切断の確認は順調であった。
in vitroにおけるNETs誘導においては、既報告と同条件でのNETs誘導は予定通り行うことが出来た。一方で、GFP発現のための長時間観察をするための条件設定において、誘導薬物濃度・観察時間・細胞生存性の調整が難航し、予定よりも時間を要した。

Strategy for Future Research Activity

PAD4-GFPノックインマウスのフェノタイプ確認のため、下記2つ実験を行う。
①in vitorにおいて、末梢血を用いてNETsを誘導し、GFP発現を確認する。
②in vivoにおいて虚血腎障害を誘導し、NETs誘導部位におけるGFP発現を確認する。
これらフェノタイプが確認できたら、虚血腎障害時の腎内のNETs動態・クリアランスを経時的に観察するために、in vivoイメージでGFP陽性細胞の動態を観察する。