2019 Fiscal Year Research-status Report

腎疾患におけるナトリウム利尿ペプチド系－p38MAPKのクロストークに関する研究

Research Project

Project/Area Number	19K17739
Research Institution	Kyoto University
Principal Investigator	森慶太京都大学, 医学研究科, 特定助教 (00769507)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	p38MAPK / ナトリウム利尿ペプチド / GC-B / 腎障害
Outline of Annual Research Achievements	p38MAPKの腎障害における機能を確認するために、p38MAPK-floxマウスと、腎臓近位尿細管特異的CreであるNdrg1-CreERT2ならびに全身の薬剤誘導性CreであるRosa26-CreERT2を交配し、1)近位尿細管特異的p38MAPK-cKOマウスと2)全身薬剤誘導性p38MAPK-cKOマウスの交配作出を試みた。近位尿細管特異的cKOに関しては、作出に成功し、タモキシフェン投与によりp38MAPK mRNAおよび蛋白レベルで発現が抑制されることをRT-qPCRおよびウェスタンブロットにより確認した。さらに、蛍光免疫染色より、リン酸化p38MAPKは非障害腎では集合管、片側尿管結紮や虚血再還流などの障害腎では集合管に加え近位尿細管に認められることを確認し、cKOマウスではリン酸化が抑制されていることを確認した。さらに、片側尿管結紮モデルでは、cKOの線維化などの組織的腎障害はコントロールと比べて変化が認められなかったのに対し、虚血再還流のday3では腎障害、腎機能悪化が抑制されている傾向を確認した。すなわち、p38MAPKのリン酸化は、慢性期よりむしろ急性期の腎障害に関与している可能性が示唆された。全身性cKOマウスは、タモキシフェン未投与下では正常に産出・成長することを確認した。タモキシフェンの投与により、mRNAおよび蛋白レベルで発現が抑制されることをRT-qPCRおよびウェスタンブロットにより確認した。cKOは非腎障害の状態でも貧血および体重減少がタモキシフェン投与後徐々に進行することを認め、既報のように造血細胞の増殖・維持に関与している可能性が示唆された。そのため、タモキシフェン投与早期からの腎障害モデル作製を試みている。 GC-B cKOマウスに関しては、前述のNdrg1-CreERT2との交配して作出に成功し、mRNAでの発現抑制を確認している。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason p38MAPKの動物モデル作製および機能解析については概ね予定通り進行している。p38MAPKのリン酸化がさまざまな腎構成細胞で認められていることは報告されているが、どのセグメントで特に認められるかについての詳細な解析は少ない。それに対し、同研究では、障害時に近位尿細管や集合管で特にp38MAPKのリン酸化が認められることを免疫蛍光染色を用いて明らかにしつつある。また、p38MAPKの阻害薬投与による腎保護については、これまで多く報告されているが、実際に細胞レベルでの作用や寄与については未知の部分が大きいが、同研究において、近位尿細管のp38MAPKの発現（およびリン酸化）を抑制することが腎障害を抑制しうる可能性を初めて確認している。おり、特に、複数のモデルにおいてその機能寄与が異なることについては非常に興味深く、p38MAPKの腎病態における役割についてさらに検討を進める予定である。また、全身性cKOについては、既報で示唆されるように腎臓以外の表現型が認められ、腎障害と全身の相互作用におけるp38MAPKの役割の解析に有用である可能性に注目しており、解析を進めている。 GC-Bの動物モデル作製については発現解析を進め、mRNAレベルの抑制については確認できたが、蛋白レベルでの評価に難渋している。現在、単独cKOに対して腎障害モデルを作製し、障害・機能評価を行っている。
Strategy for Future Research Activity	p38MAPKの動物モデル作製および機能解析については概ね予定通り進行している。特に、複数のモデルにおいてその機能寄与が異なることについては非常に興味深く、p38MAPKの腎病態における役割についてさらに検討を進める予定である。また、全身性cKOについては、既報で示唆されるように腎臓以外の表現型が認められ、腎障害と全身の相互作用におけるp38MAPKの役割の解析に有用である可能性に注目しており、解析を進めている。 GC-Bの動物モデル作製については発現解析を進めているが、蛋白レベルでの評価に難渋しており、来年度への課題としている。同動物は単独での評価のみならず、p38MAPKとのクロストークを見る目的も掲げており、double KO動物作製を進めていく。ヒト検体の評価については、前述のようにp38MAPKの腎病態への寄与の違いがあることが興味深いため、マウスを用いてp38MAPKの寄与が大きいことが予想される病態の選出・比較を進め、ターゲットを絞っていく予定である。