2019 Fiscal Year Research-status Report
アトピー性皮膚炎における皮膚真菌叢の変化と特異的IgE抗体獲得機序の解明
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19K17773
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
森脇 昌哉 広島大学, 医系科学研究科(医), 専門研究員 (10839286)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | MGL_1304特異的IgE / MGL_1304 / Malassezia globosa / 皮膚細菌叢 / 汗アレルギー / 樹状細胞 / ランゲルハンス細胞 / 自然免疫 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
アトピー性皮膚炎(AD)は、長期にわたり皮膚炎を繰り返す慢性疾患である。AD患者は汗が増悪因子と知られており、特に汗に含有されるMGL_1304（皮膚上のMalassezia globosaが産生）が汗アレルギーの原因物質であることを当教室で示してきた。しかし、AD患者がMalassezia globosaが産生するMGL_1304に対する過敏性を示すことや、AD患者がMGL_1304に対する特異的IgE抗体を持つことを見出してきたが、その機序については明らかとなっていない。
近年、IgE産生について濾胞性ヘルパーT細胞(Tfh)の関与が指摘されており、今回表皮からランゲルハンス細胞や樹状細胞といった抗原提示細胞を介し、Tfhへの分化を経て、MGL_1304に対する特異的IgE抗体をB細胞から産生される機序について検討を行っている。
まず、末梢血からin vitroで単球由来皮膚ランゲルハンス細胞（MoLC）を作製し、同一ドナーからCD4+T細胞も併せて分離した。Malassezia globosa(死菌)とMGL_1304に加えて、TSLP，LPS，Pam3などの各種刺激下に培養を行い、活性化したMoLCの作成まで行った。
次に先に作成した活性化MoLCと CD4+T細胞を7日間共培養し、Ｔ細胞の分化を行った。flowcytemetoryにてCD185+CD279+のT細胞をTfhとして回収した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
PBMCから単球（Mo）を単離後、GM-CSFとIL-4、TGF-β刺激にて単球由来ランゲルハンス細胞（MoLC）を作成した。その後、熱処理したMalasezzia globosa（重症ADの皮膚で優位）とLCの分化・遊走に関与するTSLPを添加・24時間培養した。24時間培養後、TLR2、LC活性化マーカー（CD83）の発現をフローサイトメトリーにて確認した。
次に、PBMCから単離したnaive T cellとMalasezzia globosa刺激後の活性化したMoLCを37℃、CO2 incubatorにて7日間共培養を行い、濾胞性ヘルパーT細胞（Tfh）の作成を試みた。フローサイトメトリーにて、Tfhの回収を試みるも、再現性が乏しく、Tfh作成における条件検討を現在行っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
MGL_1304に特異的なTfh作成を安定させた後、naive B cellとTfhの共培養を行い、Bcellから産生されるMGL_1304特異的IgEをELISA等で確認を行う。
naive TcellからTfhへの分化が現在の系では安定しないため、再現性が得られない場合、Pan T cellを使用することでTfhへの分化がみられるかどうか検討を行う。また、PBMCからTcellの回収を行う際、回収率が低くなる傾向があり、その場合、CD3/28刺激などを使用し、細胞数の増加を試みる。
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| Causes of Carryover |
プロトコルに沿って、研究を進めていたが、Tfh作成の再現性が安定せず、その先のプロトコル（B cell isolation後、共培養及びIgEについての探求）まで進むことができず、消耗品（試薬等）の購入を控えたため。
今後はプロトコルに沿って、MGL_1304に特異的なTfh作成を安定させた後、naive B cellとTfhの共培養を行い、Bcellから産生されるMGL_1304特異的IgEをELISA等で確認を行う。
TfhをexpansoinするCD3/28やELISA用の試薬等の購入を行う。
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