2021 Fiscal Year Research-status Report

包括的アプローチによる血管型エーラス・ダンロス症候群の分子遺伝学的発症機序の解明

Research Project

Project/Area Number	19K17795
Research Institution	Shinshu University
Principal Investigator	山口智美信州大学, 医学部附属病院, 助教(特定雇用) (90802835)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2023-03-31
Keywords	血管型エーラス・ダンロス症候群 / 遺伝性結合組織疾患 / 次世代シークエンス / 分子遺伝学的発症機序
Outline of Annual Research Achievements	エーラス・ダンロス症候群（Ehlers-Danlos Syndrome; EDS）は皮膚の過伸展性、関節の過可動性、各種組織の脆弱性を特徴とする遺伝性結合組織疾患である。その中で、血管型EDSは、動脈病変、S状結腸破裂、子宮破裂などの致命的な合併症を生じうる重症病型である。信州大学医学部附属病院遺伝子医療研究センターでは、次世代シークエンス（Next generation sequencing; NGS）を利用した遺伝性結合組織疾患・原因遺伝子パネル解析（NGSパネル解析）を実施してきた。しかし、血管型EDSが疑われた患者のうちの7割弱において病的バリアントは検出されず、コピー数異常を含む構造異常、イントロン深部・転写調節領域・他の遺伝子における病的バリアントの存在が想定された。本研究は、NGSパネル解析陰性例に対する（1）NGSデータを用いたコピー数解析、（2）mRNA解析、（3）ロングリードNGSによる全ゲノム解析を通じて、血管型EDSの分子遺伝学的発症機序の包括的解明を目指している。（1）コピー数解析：新たに34例を解析し、現在までに計367例の解析が終了している。なお、疾患の発症と関連があると考えられるコピー数異常を新たに認めた例はなかった。（2）mRNA解析：皮膚線維芽細胞保管検体からの解析検体の選定、追加検体の細胞培養等を行った。（3）ロングリードNGS解析：解析対象を、Long-PCR産物あるいはCRISPR/Cas9システムで得られた産物とした。Long-PCR産物のシークエンスでは解析可能なデータが得られている。CRISPR/Cas9システムの方も、プローブを設計し、調製中である。また、血管型EDSにおけるNGSパネル解析結果（NGSデータを用いたコピー数解析結果を含む）を論文にまとめ、投稿した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason （1）コピー数解析：367例を解析し、6例においてEDS関連遺伝子にコピー数異常を認めた（一部エクソンに増減を認めた3例と遺伝子全域で増減を認めた3例）。MLPA法による検証を行い、コピー数異常を確定した（遺伝子全域でのコピー数増加を認めた2例については、ロングリードNGSを用いたゲノム構造解析へ）。（2）mRNA解析：皮膚線維芽細胞保管検体からの解析検体の選定、追加検体の細胞培養等を行った。（3）ロングリードNGS解析：遺伝子全域でのコピー数増加を認めた1例についてはロングリードNGSを用いたゲノム構造解析を実施した（解析対象は全ゲノム）。その後、同時に多数の検体を解析するべく、解析対象を、Long-PCR産物あるいはCRISPR/Cas9システムで得られた産物に変更した。Long-PCR産物を解析対象とするのは、臨床症状から疑われるものの、翻訳領域およびスプライス部位には病的バリアントが検出されていない症例で、イントロン深部や転写調節領域のバリアント検出を想定している。CRISPR/Cas9システムで得られた産物を解析対象とするのは、遺伝子全域でのコピー数増加を認めたもう1例などの大規模な構造異常の解析を想定している。Long-PCR産物のシークエンスでは解析可能なデータが得られている。CRISPR/Cas9システムの方も、プローブを設計し、調製中である。また、血管型EDSにおけるNGSパネル解析結果（NGSデータを用いたコピー数解析結果を含む）を論文にまとめ、投稿した。結果として、その他の業務による多忙で研究を円滑に進めることができなかったため、補助事業期間の延長を申請し、承認を得た。
Strategy for Future Research Activity	2021年度は、ロングリードNGS解析の対象を、Long-PCR産物あるいはCRISPR/Cas9システムで得られた産物としたことで、ロングリードNGS解析の活路を見出した。2022年度は、この方法を用いて、（1）病的バリアント未検出例のゲノムDNA解析、（2）病的バリアント未検出例のmRNA解析、（3）遺伝子全域でコピー数異常を認めている症例などに対するゲノム構造解析を実施する。NGSパネル解析の陰性症例に対するコピー数解析については、新たな症例を追加し、2022年度も継続して取り組む予定である。
Causes of Carryover	その他の業務の多忙により研究を円滑に進めることができず、補助事業期間の延長を申請したため、次年度使用額が生じた。2022年度は、Long-PCR産物あるいはCRISPR/Cas9システムで得られた産物を対象としたロングリードNGS解析を中心に実施する。そのための消耗品費、学会参加費、英文校正費として使用する予定である。